细胞内双反应性药物递送的聚乙二醇.docx

细胞内双反应性药物递送的聚乙二醇-聚（二硫氨基甲酸酯胺）嵌段共聚物的自组装胶束 在酸性和还原反应中PEG-SSPCA胶束的不稳定特性作为一个例子，通过跟踪他们的大小的变化，研究酸或还原条件对PEG-ssbap胶束的影响 在室温下PEG - SSPCA胶束粉末溶于磷酸盐缓冲液（pH 7.4、pH 6.5、pH 5.5、20 mM）在DTT 的存在或不存在（ 0 . 5 m M ）培养12小时利用动态光散射测量大小PEG-SSPCABAO包载药物和药物毒性测试装载DOX PEG - SSPCA胶束通过透析的方法进行总之，阿霉素/盐酸盐（1mg）和三乙胺（10ul） 溶解在DMSO （1ml）下搅拌过夜PEG - SSPCA共聚物（10mg）也被溶解在DMSO （1ml） 含三乙胺（10ul）接下来，DOX和共聚物的溶液混合均匀，滴加去离子水（10ml）在圆底 烧瓶搅拌下超过2小时最终的步骤是去离子水（2*5L）经透析（10k MWC0）残留的溶 液通过膜过滤（0.45um，微孔）和最终在冷冻干燥后得到一个红色的粉末载药量（DLC） 和载药效率（DLE）分别用下列方程计算：DLC=（载带药物的量/药物载带胶束的量）*100%， DLE=（载带的药物的量/投加的药物总量）*100%。

阿霉素在肿瘤细胞中的转运细胞内阿霉素载带胶束转运是在Z-Stack扫描模式用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察 简而言之，MCF-7或者SKOV-3种在玻璃的24孔板上密度控制在5*10A4，在37度和潮湿的 5%CO2环境中孵化24小时阿霉素载带PEG-SSBAP胶束在培养基中与细胞一起孵化 在1,4,24 小时，利用干净的PBS缓冲液来清洗细胞，和干净的冷丙酮混合，用DAPI （1%）染色10 分钟，在红细胞荧光成像在CLSMZ-Stack扫描模式可以看见PEG-SSBAP 胶束的抗癌效果通过HepG2, SKOV-3, MCF-7等癌细胞来对阿霉素载带PEG-SSBAP胶束的抗癌活性进行评估 细胞（个数 10000）和胶束在 96 孔板上加入阿霉素的浓度在 0.001-10ug/ml 的培养基孵化 24 小时根据操作说明利用阿尔玛蓝在检测细胞活性未经处理的细胞（空白组）的存活 率为100%在相同的浓度下Dox单独的抗癌活性被设置为控制组不同浓度（5-400ug/ml） 的PEG - ssbap共聚物的毒性进行了检测，对细胞和PEG-SSBAP在培养基中共同孵化24小时 后的细胞毒性。

同时，对PEG - ssbap降解产物，即BAP和半胱胺，使用相同的方法测试毒 性动物实验 结论PEG-聚（氨基甲酸酯胺）嵌段共聚物的合成和表征在这项工作中，一系列新的PEG-聚（二硫氨基甲酸胺）（记为PEG - SSPCA）的嵌段共聚物 通过2,2'-二硫乙二醇-双（对硝基苯基碳酸酯）（DTDE-PNC）和氨基封端的PEG的混合物（PEG-NH 2）和一个含叔胺伯二胺聚合反应，然后用过量二元胺终止反应三个二元胺通过 各种方式被应用于 PEG-SSPCA 胶束在聚（氨基甲酸酯）块 （图 1）粗产物完全溶解在酸性 水溶液（pH = 5）和通过超滤过程纯化，以消除低分子量的聚合物和非共轭的聚乙二醇，冷 冻干燥后，得到作为盐酸盐的形式的三个共聚物在DMF和水溶性测试中显示这些共聚物 被溶解，测试浓度是1mg/ml.核磁共振谱分析表明，PEG - SSPCA共聚物的化学成分均与预 期一致（图S1 ,从光谱图上，6 7.3和& 8.3处的信号在对硝基苯残留的芳香质子，不能被 检测到，表明 PEG- SSPCA 共聚物由伯胺端基和对硝基苯残留应在终止反应完全消耗 PEG - ssbap的红外分析在化学位移1700厘米cm-1和1530cm-1处有两个信号峰，是在聚合物 中中氨基甲酸酯键的C=O键（图S2）。

GPC测试表明这些PEG - SSPCA共聚物具有单模色谱 峰（图 S3）在体外实验形成的PEG - SSPCA纳米胶束对于药物的载带和释放探索PEG-SSPCA共聚物是否形成胶束，这些共聚物的溶液分别进行了动态光散射（DLS）和 透射电子显微镜（SEM结果发现，这些共聚物自组装在纳米颗粒的范围内形成纳米级的 胶束直径范围是141-214nm （表二）这些PEG - SSPCA胶束的尺寸分布较窄（PDI在0.12 -0.26）和单峰模式此外，聚（氨基甲酸酯）块的结构对PEG - SSPCA颗粒粒径有一定影 响PEG - SSBAP胶束具有最小的尺寸，可能由于BAP （2,2-双（3-氨基-4-羟基苯基）丙烷）残 渣的疏水性能通过DLS分析和透射电镜下观察到的球形形貌 图2a显示了一个典型的PEG - SSBAP胶束的粒度分布的峰值在PBS溶液中对不同浓度的PEG - SSPCA进行荧光光谱分 析而且有一个芘探针提供这些共聚物的临界胶束浓度（CMC）图S5，表二），反映的 PEG-SSPCA胶束疏水区PEG - SSPCA共聚物的CMC值可以通过氨基酸残基的结构调整PEG -SSBAP在这三种共聚物中具有最小的CMC （24.5ug/ml）,因此更具有研究前景。

在酸性或 还原性条件下，通过检测PEG - SSBAP胶束的粒径，对PEG - SSPCA胶束响应细胞内环境的 能力进行评估在图 2b 中可以看出， PEG-SSBAP 胶束的大小在 PH7.4 的 PBS 缓冲液中稳定 12个小时然而，当pH环境从7.4下降到6.5和5.5,胶束的大小显着增加从141nm-192nm 再到225nm，这表明PEG - ssbap胶束酸反应能力另外，在延长培养时间从12小时增加到 24小时，胶束的大小从225 nm增加到458 nm在（氨基甲酸酯胺）单元这种酸的反应行 为归因于叔胺的质子化作用PEG-SSBAP的酸碱滴定分析进一步支持了这一点，表明了叔胺 的质子化程度从44%增加到 62%，而且 PH 值从 7.4 减小到 5.5（图 S4b 除了酸响应特征， PEG - SSBAP胶束有还原反应谱例如，胶束在1mmol/L的DTT （1mmol/L）硫醇模拟细胞 内的还原条件）中孵化12小时，胶束的尺寸显著增强从141nm-186nm （图2C）这种还原 反应在孵化24小时后变得更加明显，会出现一个更大的尺寸1127nm总的来说，这些结 果表明， PEG- SSBAP 胶束在生理条件下可以相对稳定，但在酸性、还原环境不稳定，暗示 细胞可能在细胞内不稳定，有一个药物释放响应。

为了测定PEG-SSCPA胶束的药物载带，将一种抗癌药物，阿霉素，通过传统的渗析的方式封 装到胶束DLS分析揭示了 Dox载带后PEG-SSCPA胶束的相比单独的PEG-SSCPA胶束出现轻 微的放大（表二）但是尺寸分散性也变大了，可能是阿霉素编入进疏水性的SSCPA单元， 引起尺寸的增加分别测试载药量（DLC）和载药率（DLE）（表二）PEG-SSBAP表现出高的 药物 DOX 载带能力，适中的 DLC 为 5.7%， DLE 为 65.4%此外从四个独立的批次，可以看 出PEG-SSBAP的DLC为5.7+—0.5%,这是类似或高于在以前的报告中的双响应共聚物例如其次，在酸性和/或还原环境，模拟细胞内的微环境，对阿霉素从聚乙二醇- ssbap胶束负载 的阿霉素释放出来进行评估图2d）在一个生理环境中（PH=7.4）, PEG-SSBAP胶束在72 小时内可以看出一个较低的药物释放，20%的累计药物释放但是药物释放率被提升随着PH 被调节到6.5 （核内体PH）在这种情况下，82%载带的阿霉素被释放出来在相同的时间内 当胶束在PH为5.5的环境中被孵化（溶酶体PH）在这种情况下，药物释放率提升了。

举 个例子，在10小时内，PH为5.5时检测到40%的阿霉素从胶束中释放出来但是当PH=6.5 时，只有20%的阿霉素释放药物释放率的提高可能是由于PEG-SSBAP的不稳定而且PH从 6.5减小到5.5 （图2b），酸性下降进一步研究，从胶团中进行高效的药物放被发现是在 还原情况下（0.5mMDTT）,这是由于二硫化物分裂导致胶团不稳定的结果图2c）值得 注意的是，任一酸性或还原性条件下，发现药物释放的不足,72小时内累计DOX释放为80 % 然而，在酸性和还原性的环境，例如，pH值5.5加0.5毫摩尔每升DTT，在10 h内即可发现 PEG-ss）ap胶束累积DOX释放率为100 %，（图2d），表明，这样的双响应胶束能更有效的 在细胞内进行完整的药物释放通过在 CLSM 在三维重建模式下测 DOX 发出的红色荧光信号进行观察， PEG- ssbap 胶束负 载阿霉素在MCF-7细胞中的细胞内分布，图三表示了胶束在细胞内1 h和24 h后的细胞内 分布（只有DOX存在下作为控制组），孵育后的胶束（或DOX）与细胞这些细胞和PEG-SSBAP 负载阿霉素一起孵化在孵化后一个小时后，细胞核和细胞质内有红色荧光信号。

图 3c）， 这些不同可能归因于PEG-SSBAP负载的DOX由于它们几乎中性的表面电荷他们会经历较慢 的细胞内吞，但是单独的DOX可通过快速分子扩散进入细胞在卵巢癌细胞中也观察到类 似的现象，孵育1 h后，在PEG-SSBAP负载的DOX胶束主要存在于细胞质中而游离DOX位 于细胞核内（图S6）在胶束与细胞孵育4或24小时后，DOX在MCF-7细胞中的积累水平 明显增强（图3b和c）.此外，红色荧光聚集在细胞质中观察到的可能是由于胶束的一部分 位于内体/溶酶体.通过CLSM图像也进一步证明了这一观点，可以在溶酶体内检测到DOX的 红色荧光图S7）因为胶束在和细胞共同孵化24小时后，释放的红色荧光信号在细胞核 中图3c和e） , PEG - ssbap胶束有传递和释放DOX进入细胞的能力最有可能的是，胶 束可以通过在酸性或还原微环境细胞内失稳释放DOX，从而诱导DOX定位在细胞核中进 一步的研究可能集中在胶束的细胞内定位，通过荧光探针对核内体进行染色，细胞内吞途径 和胶束和DOX扩散的潜在核内体逃逸的详细机制在体外实验检测PEG-SSBAP的抗癌机制既然PEG-SSBAP胶束包裹的阿霉素在生理环境中释放的非常的慢，但是在细胞内环境中是有 效率的，胶束是一种很好的控制药物释放抵抗毒性的载体。

在体外实验的研究中揭示了 400ug/ml 的 PEG-SSBAP 本身在 MCF-7、Hep G2 和 SKOV-3 的微小毒性图 4a），表明了 PEG-SSBAP 胶束的好的细胞相容性 BAP 和半胱胺作为 PEG-SSBPA 的副产品当其浓度在 400ug/ml时在MCF-7、H e p G2和SKOV-3细胞中表现出很低的细胞毒性，细胞活性要大于 80%图S8）相反的，PEG-SSBAP负载的阿霉素在细胞中有细胞毒性图4b-d）进一步 发现胶束的抗癌活性与细胞株类型相关举一个例子， 5ug/ml 的阿霉素浓度，负载的 Dox 胶束有效的抑制SKOV-3和H e p G2细胞的增长细胞活性为60%），但是在MCF-7中的抑 制作用适中，细胞活性表现为90%，除了细胞的种类，阿霉素的浓度对于癌细胞的敏感性是 影响抗癌活性的另外的一个影响因素这个可以理性的解释为对于HepG2细胞，胶团可以 与Dox比较抗癌活性，在dox的浓度为1-10ug/ml时图4d）但是在一个低的do x浓度 （0.1-1ug/ml），在所有的这些癌细胞中，PEG-SSBAP负载的阿霉素的抗癌效力是比单纯的阿 霉素差的，这是因为Dox纯物质可以快速的进入细胞核并且插入DNA来杀死细胞，但是胶 束需要更长的时间来转移并且脱掉Dox让其进入细胞核，这些假设可以通过Dox的分布数 据来支持（图3d/。