基因分析的基本策略PPT课件[通用].ppt

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,从上世纪,70,年代以来，与,DNA,、,RNA,操作相关的各种分子生物学技术不断发展，到目前已经形成了一个庞大而复杂的技术体系基因操作已成为医学研究的重要手段简单地说，基因操作就是所有涉及到,DNA,、,RNA,操作的技术本章主要讨论如何对基因进行定性、定量分析；在随后的,2,章里分别介绍基因功能研究的技术和基因工程的有关内容第六章 基因分析的基本策略,1,、需要进行基因的,DNA,序列分析,:,序列测定,2,、基因的染色体上定位：原位杂交技术,3,、研究基因在基因组中的拷贝数：,Southern Blot,4,、研究基因表达水平：,Northern Blot,、逆转录实时,PCR,技术,5,、研究基因表达产物的水平：,Western Blot,、流式细胞仪（,FACS,）,对一个已知或未知基因的内容进行研究步骤：,第一节 利用,DNA,定性、定量分析可从不同角度,对基因和基因组进行研究,一、,DNA,序列测定可以揭示基因和基因组一级结构变化,DNA,测序技术：,1,、双脱氧链终止法,(Sanger,法,),2,、化学裂解法,3,、,PCR,测序技术,4,、全自动,DNA,测序仪,这些技术的发明,都依赖于高分辨率的聚丙烯酰胺凝胶电泳技术,Sanger,双脱氧链终止法引入了双脱氧核苷三磷酸（,2,3-ddNTP,）作为链终止剂。

2,3-ddNTP,脱氧核糖的,3,位缺少羟基，它可以与多核苷酸链的,3,羟基形成磷酸二酯键，但却不能与下一个核苷酸缩合，导致多核苷酸链的延伸终止如果在,DNA,的合成反应中，加入一种少量的,ddNTP,，则多核苷酸链的延伸将在随机的位点终止，生成一系列长短不一的核苷酸链在,4,组独立的,DNA,合成反应中，分别加入,4,种不同的,ddNTP,，结果生成的,4,组核苷酸链将分别终止于各个,A,，,G,，,C,，,T,的位置上对这,4,组核苷酸链进行高分辨变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，就可读出序列双脱氧测序方法,原理,基本步骤：,1,、先将,DNA,的末端之一标记放射性同位素（,32,P,、,35,S,），,2,、再将,DNA,样品分别进行多组具碱基特异性、随机的、不完全的化学修饰；,3,、采用修饰碱基敏感的特异化学试剂在修饰碱基位置断开,DNA,链；,4,、通过具有可分辨链长短仅一个核苷酸之差的聚丙烯胺凝胶电泳，将,DNA,断裂片段按分子大小分离开,5,、根据放射自显影胶片上显示的末端标记片段分布情况，直接读出,DNA,序列化学裂解法（,Maxam-Gilbert,）,1977,反应体系 碱基修饰 碱基修饰 主链断裂 断裂点,试剂 反应 试剂,G,硫酸二甲酯 鸟嘌呤甲基化 六氢吡啶,G,G+A,甲酸 脱嘌呤作用 六氢吡啶,G/A,C+T,肼 嘧啶开环 六氢吡啶,C/T,C,肼（加盐）胞嘧啶开环 六氢吡啶,C,在化学修饰反应中，通过控制反应温度和反应时间，只有一小部分碱基被修饰，随后进行断裂反应也是定量。

5-GATCACTACTG-3,5*-,GATCACTACTG-3,5*G,5*GATCACTACTG,5*G,5*GA,5*GATC,A,5*GATCACTA,5*GATCACTACTG,5*GAT,5*GATC,5*GATCAC,5*GATCACT,5*GATCACTAC,5*GATCACTACT,5*GATC,5*GATCAC,5*GATCACTAC,G,G+A,C+T,C,G A/G C/T C,5*,G,5*G,A,5*GA,T,5*GAT,C,5*GATCA,C,5*GATCACTAC,5*GATCA,5*GATCAC,T,5*GATCACT,A,5*GATCACTA,C,5*GATCACTAC,T,5*GATCACTACT,G,硫酸二甲酯,甲酸,肼,肼（加盐）,DNA,自动测序仪,上述两种方法都不适应大规模,DNA,测定需要存在操作步骤繁琐、效率低、速度慢的缺点，特别是读结果的读片过程1987,年发明了一种准确快速的,DNA,测序方法，即激光测序法和配套的自动测序仪用荧光染料结合引物）随后又发明了终止标记系统法1,、揭示基因和基因组一级结构变化在医学研究中具有重要意义2,、通过,DNA,序列分析，可以鉴定基因和基因组变异。

3,、通过,DNA,序列分析，可以鉴定分析人工重组的基因4,、通过,DNA,序列测定对定点突变进行确认DNA,序列测定的意义,分析基因拷贝数变化,一、,Southern blot,检测基因拷贝数变化,Southern blot,印迹杂交是指,DNA,与,DNA,的杂交，将电泳分离的待测,DNA,片段转印并结合到一定的固定支持物上，然后用标记的,DNA,探针检测待测,DNA,的一种方法1975,年英国爱丁堡大学的,Southern,建立了该方法，,Southern,印迹杂交由此得名Southern blot,步骤,（,1,）,待测核酸样品的制备,：提取基因组,DNA,，并用适当的限制性内切酶消化水解基因组,DNA,，成大小不一的,DNA,片段2,）,待测,DNA,样品的电泳分离3,）,凝胶中核酸的变性,：,DNA,在制备与电泳过程中,DNA,片段始终保持双链结构电泳结束后,DNA,变性并转移到适当的固定支持物上才能进行,Southern blot,变性通常用碱变性法4,）,Southern,转膜,：将凝胶中的,DNA,进行碱变性并将,PH,恢复中性后，即可将凝胶中,DNA,转移到固定支持物上。

固定支持物,：硝酸纤维素（,NC,）膜、尼龙膜、化学活化膜和滤纸等转移方法,：毛吸管虹吸印迹法、电转印迹法、真空转移法5,）已知序列的,DNA,探针的制备,（,6,）,Southern,杂交,：在将固定于膜上的,DNA,片段与探针进行杂交前，必须先进行一个,预杂交,的过程因为能够结合,DNA,的膜同样可以和探针,DNA,结合，在进行杂交实验前，必须将膜上所有能与,DNA,结合的位点全部封闭7,）,杂交结果的检测,：采用核素标记的探针或发光剂标记的探针进行杂交时，在杂交洗膜后，将滤膜和,X,线片装入暗盒，感光后，经冲洗，在,X,线片上可见黑色条带1,、对某种生物体基因组拷贝数研究，需要完整提取出基因组，并需要适当的限制性内切酶酶切；,2,、通常要研究的基因序列是已知的Southern blot,检测基因拷贝数注意事项,二、采用,PCR,技术也可以分析基因拷贝数,原理：,细胞内,DNA,复制是一个复杂过程参与复制的有多种因素PCR,是在试管中进行的,DNA,复制反应，,PCR,原理与细胞内,DNA,复制相似，但反应体系相对简单PCR,反应体系：,耐热的,Taq DNA,聚合酶、化学合成的寡聚核苷酸引物、,4,种,dNTP,、以及合适的缓冲液体系。

PCR,反应的基本过程：变性、退火、延伸,PCR,技术对扩增的模板浓度虽然很低，扩增产量以一个恒定的指数率上升，但经过,25,至,30,个循环，产量会达到一个平台期，同时,PCR,过程中，还会出现,“,试管效应,”,，因些对不同样本量的比较无法直接用,PCR,技术来鉴定近年来，随着,PCR,技术的不断改进，如差异显示,PCR,和实时,PCR,的发明，可以用于基因拷贝数的分析是根据绝大多数真核细胞,mRNA3,端具有的多聚腺苷酸尾（,polyA,）结构，因此可用含,oligo,（,dT,）的寡聚核苷酸为引物将不同的,mRNA,反转录成,cDNA,根据,Poly A,序列起点前,2,个碱基除,AA,外只有,12,种可能性的特征，设计合成了,12,种下游引物，称,3-,锚定引物,；同时为扩增出,polyA,上游,500bp,以内所有可能性的,mRNA,序列，在,5,端又设计了,20,种,10bp,长的随机引物这样构成的引物对进行,PCR,扩增能产生出,20000,条左右的,DNA,条带，其中每一条都代表一种特定,mRNA,种，这一数字大体涵盖了在一定发育阶段某种细胞类型中所表达的全部,mRNA,。

将差别表达条带中的,DNA,回收，扩增至所需含量，进行,Southernblot,或,Northernblot,或直接测序，从而对差异条带鉴定分析，以便最终获得差异表达的目的基因1,）差异显示,PCR,用于基因拷贝数分析,尽管应用,差异显示,PCR,方法已经取得了不少成果，而且该方法还在不断改进之中，但它仍然存在几个难以解决的问题：但它仍然存在几个难以解决的问题：,(1),重复率低，至少有,20%,的差异条带不能被准确重复；,(2),假阳性率可以高达,90%,；,(3),获得的差异表达序列极少包含编码信息2,）、代表性差异分析技术,该技术是将差减杂交与,PCR,有机结合形成的一种方法,.,主要步骤,:,1,、将对照组,(driver),和待测组,(tester)mRNA,逆转录成,cDNA,片段群,接上接头进行第一次,PCR,扩增,;,2,、将两组,PCR,产物片段群用限制性内切酶酶切,形成平均长度,256bp,的长度,.,3,、将接头消化,在,tester,组末端接上新的接头,tester,组和,driver,组按,1:100,比例混合,.,过量的,driver,可与,tester,中互补的部分形成双链,.,4,复性,按新接头序列设计引物进行第,2,轮,PCR,，只有,tester,和,tester,杂合体才能和引物配对,大量拉增,.,实时,PCR,根据,PCR,反应动力学特点设计的分析方法。

在,PCR,反应的初始阶段，反应体系中的模板的产物深度较低，而引物是过量的，产物和模板复性不会形成与引物竞争，此时产物含量呈指数增加当,PCR,产物积累后，产物的复性可以竞争引物与模板的结合，产物增加减慢，最后进入平台期所以对样品中的,cDNA,进行定量分析的最佳时期是反应早期有人试图依靠循环次数减少来分析样品中的,cDNA,含量，但因样品的差异使之很不可靠在一定的循环中，,mRNA,丰度低的样品产量少，可能尚不能检测，丰度高的样品可能已进入平台期，故难以较3,）实时,PCR,用于基因拷贝数分析,实时,PCR,原理是：在,PCR,反应体系中加入一种双色荧光标记的寡核苷酸探针，并根据探针上荧光信号的变化计算模板,DNA,含量如：,TaqMan,系统,在寡核苷酸探针的,5,端标记一个报告荧光染料，,3,端标记一个猝灭染料当光源照射到探针时，被激活的报告荧光染料将能量转移给附近的猝灭染料而不发光当,PCR,产物扩增时，聚合酶遇到结合在模板上的荧光探针时，利用聚合酶所具有的,5-3,外切酶作用，将两种染料分离，因此根据报告荧光所发射的荧光强度与被切探针成正比，由此可以计算出,PCR,产物的含量。

实时,PCR,技术特别适合于低拷贝基因的定量实时,PCR,需要包括热循环仪、计算机、光学仪器用于荧光激发和收集器、数据处理和分析软件核酸保持在细胞或组织切片中，经适当方法处理细胞或组织后，将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交，称为,原位杂交,原位杂交不需要从组织提取核酸，对组织中含量极低的靶序列有很高的灵敏度，并可完整保持组织与细胞形态，更能准确反映出组织细胞的相互关系及功能状态三、原位杂交技术可以分析基因在染色体上位置,根据检测对象不同可将原位杂交分为,细胞内原位杂交,和,组织切片原位杂交,同时原位杂交既可检测,DNA,，也可检测,RNA,，所用探针不同而以核酸探针根据标记方法的不同可粗略分为放射性探针和非放射性探针两类放射性,同。