人Tum5基因逆转录病毒载体及包装细胞株的构建临床医学论文.doc

人Tum5基因逆转录病毒载体及包装细胞株的构建_临床医学论文 作者：盖晓东 罗宏 历春 冯凯【摘要】 目的 构建携带Tum5基因的逆转录病毒载体并对其进行包装,获得稳定的产毒细胞系方法 采用RTPCR法从胎肾组织中扩增Tum5基因片断，并将其定向克隆到逆转录病毒载体pLXSN中进行PCR、双酶切和测序鉴定利用电穿孔方法将获得的重组质粒转染PA317细胞，经G418 筛选抗性克隆,收集病毒上清后感染NIH3T3 细胞测定病毒滴度结果 PCR、酶切证实Tum5基因克隆至逆转录病毒载体pLXSN，Tum5基因测序结果和原始序列相同重组逆转录病毒载体转染PA317 包装细胞,RTPCR证实转染后的PA317细胞上清液中存在携带人Tum5基因的病毒RNA,病毒滴度为2.05×104cfu/ml结论 成功的构建了携带人Tum5基因的逆转录病毒载体，获得了稳定的产毒细胞系 【关键词】 Tum5基因；pLXSN；基因 治疗 ；抗血管生成；逆转录病毒载体肿瘤的生长转移依赖于血管生成，抑制肿瘤血管的生成成为肿瘤治疗学研究的新热点肿瘤抑素（tumstatin）是最新发现的肿瘤血管生成抑制因子,可有效抑制人内皮细胞的增生,引起内皮细胞凋亡,抑制新生血管的生成,达到抗肿瘤生长的目的〔1〕。

Tum5是肿瘤抑素的抗血管生成活性片段，并与全长肿瘤抑素具有相同的抗血管活性〔2〕其抗血管生成作用要比先前发现的血管内皮抑素（endostatin）强10倍,并呈剂量依赖关系〔3〕本研究立足于抗血管生成的基因治疗原理，构建携带Tum5基因的逆转录病毒载体并对其进行包装,以获得稳定的产毒细胞系,使得Tum5用于肿瘤以及其他血管依赖性疾病的基因治疗成为可能1 材料与方法 1.1 材料 pLXSN 质粒由扬州大学馈赠，大肠杆菌菌株DH5α为北华大学生命 科学 中心保存，胎肾组织来自吉林市妇产 医院 ，Trizol和G418均购自GIBICO公司，RTPCR试剂盒、DNA纯化试剂盒、各种工具酶及Marker等均购自大连TaKaRa公司，PA317细胞购自中科院上海细胞研究所，NIH3T3细胞由东北师范大学生科院馈赠DMEM培养基、新生牛血清购自长春市博德生物公司其余试剂均为国产分析纯电穿孔使用德国Eppendorf Company生产的Multiporator型细胞融合仪Tum5引物序列由上海生工生物技术有限公司合成，P1：5′GGAATTCAATCAACGAGCCCACGGAC3′ （划线部分为EcoRⅠ酶切位点）；P2：5′CGGGATCCTTAGGCGATCGCAGGACCTCC3′（划线部分为BamHⅠ酶切位点）。

1.2 方法1.2.1 RTPCR方法扩增目的基因片段 从液氮罐中取出冻存的胎肾组织块放入研钵中,少量多次加入液氮,研成极细粉末将粉末移至离心管中,用Trizol 裂解液提取总RNA 然后以2 μg 的总RNA 为模板，以Oligo(dt)15为引物进行反转录,制备cDNA以TaqDNA聚合酶进行PCR 扩增，反应条件：94℃预变性4 min，94 ℃变性1 min，54 ℃退火1 min，72℃延伸1 min，共30个循环末次循环后再于72 ℃继续延伸10 min将得到的基因片段进行琼脂糖电泳分析,最后用PCR纯化试剂盒纯化和回收所需要的目的基因片段1.2.2 重组体pLXSNTum5的构建与鉴定 将Tum5基因片段与已进行相应酶切(EcoRⅠ+ BamHⅠ)的pLXSN载体以1∶5摩尔比混合,加入T4 DNA 连接酶16℃过夜将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α,转化菌涂于含有氨苄青霉素的LB 平板上，设立阴性对照,于37℃培养14～16 h后筛选阳性克隆挑取单菌落置于含有氨苄青霉素的LB中250 r/min,37℃过夜按质粒提取试剂盒说明书提取重组质粒，对重组质粒以EcoRⅠ和BamHⅠ进行双酶切、PCR及测序鉴定。

取测序正确的重组质粒进行下一步研究,并命名为pLXSNTum51.2.3 重组质粒转染PA317细胞及假病毒颗粒的收集 将处于对数生长期的PA317细胞传代，并用电转缓冲液将细胞制备成1×107个/ml的悬液，按每400 μl细胞悬液加入30 μg 重组质粒，在250 V、20.4 ms条件下电击将细胞加入无血清、无双抗DMEM培养基，放入37℃、5% CO2培养箱中培养，24 h后换为600 μg/m的G418培养基继续培养2 w后阳性克隆出现，挑选阳性克隆移至细胞培养板中，扩大培养，收集细胞上清液，保存于-80℃将转染重组质粒的PA317细胞阳性克隆扩大培养，提取5个不同克隆上清液的总RNA， RTPCR检测其中是否有携带Tum5的病毒颗粒存在1.2.4 重组质粒病毒滴度的测定 选取经鉴定含有重组质粒的病毒上清液行病毒滴度测定，将对数生长期的NIH3T3细胞按100个/孔接种于24孔板，每孔加500 μl DMEM全培养基培养24 h吸取浓缩病毒上清，分别用无血清DMEM中做10倍、102倍、103倍、104倍稀释，换液继续培养；2.5 h后加入含2 μg/ml多聚季胺（Polybrene）的DMEM培养液继续培养；2 d后换为含500 μg/mlG418的DMEM（含10%FNBS），分入6 cm培养皿中继续培养；12 d后记录细胞克隆数，再乘以稀释倍数后得病毒滴度。

2 结 果 2.1 PCR 反应扩增Tum5基因 PCR产物经琼脂糖凝胶电泳显示，Tum5基因扩增产物与预期条带大小相符,在255 bp处出现明显的特异扩增条带(图1) 2.2 重组质粒的构建与鉴定结果 重组体转化感受态细胞,提取质粒,经EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切鉴定,目的基因已克隆入载体，PCR结果表明重组质粒中携带Tum5基因(图2)，DNA 测序结果表明与原始序列一致，表明成功构建出携带Tum5的重组质粒pLXSNTum5 2.3 重组质粒转染PA317细胞及鉴定 将电转后的3组细胞转入细胞培养瓶中，在含G418的无双抗DMEM培养基中筛选第17天时，未加质粒的空白对照组细胞全部死亡（图3 BL17 d），而电转空质粒pLXSN与电转重组质粒pLXSNTum5两组细胞开始出现阳性细胞克隆（图3 PL17 d、PT17 d）收集转染空质粒与重组质粒的PA317细胞上清液分别提取总RNA并进行RTPCR检测，结果显示只有从转染重组质粒PA317细胞上清液提取的总RNA才能获得Tum5基因片段（图4）这说明所获得并保存的病毒上清液中确实含有携带Tum5基因片段的假病毒颗粒。

2.4 病毒滴度的测定 经重组质粒包装成的病毒颗粒感染的NIH3T3细胞，G418筛选10～14 d，镜下可见103稀释度抗G418阳性克隆出现，测得滴度为2.05×104cfu/ml，这些结果证实获得的包装细胞系具有有效滴度3 讨 论 Tumstatin是最新发现的由MMP9 蛋白水解酶从胶原蛋白Ⅳα3 链水解而来的肿瘤血管生成抑制因子〔2〕,分子量为28 kD它含有2个功能区:一个具有抗肿瘤细胞增殖作用，在靠近C 端的185～203氨基酸之间,另一个在接近N 端的54～132氨基酸之间(tum5)，可特异性抑制内皮细胞增殖和迁移,导致内皮细胞凋亡,使肿瘤血管的生成受到抑制,抑制肿瘤细胞的生长、浸润和转移但是,肿瘤抑素作为肺肾出血综合征自身抗原,可能对肾、肺和机体的其他器官造成一定的损害Tum5去除了这段序列,可降低其对机体的副作用,却不影响本身的抗肿瘤活性〔4〕因此，本实验构建了逆转录病毒载体pLXSNTum5，获得稳定的产毒细胞系,为Tum5基因 治疗 提供实验基础为了将目的基因导入靶细胞，本实验采用逆转录病毒载体基因转移与物理方法相结合的办法，电穿孔是一种高效、简便的基因转移系统，电击最大电压和电击持续时间是影响转染率的两个主要因素。

电压太小和(或)持续时间太短，则转染率太低;如果电压太大和(或)持续时间太长，则电击后细胞不能存活，也影响转染率本实验采用的条件是250 V、20.4 ms逆转录病毒载体具有整合能力强、易稳定表达等优点,因而常被选择用做转基因细胞的构建和基因生物学功能的研究目前有许多荧光蛋白对靶细胞体外增殖能力造成影响的报道〔5，6〕，因此笔者选择了具备NeoR基因不带荧光蛋白的逆转录质粒pLXSN包装细胞能将转入的逆转录病毒质粒在细胞内部进行加工、包装，形成假病毒颗粒，以胞吐形式分泌到细胞上清液中用含假病毒颗粒的包装细胞培养液上清感染靶细胞,则假病毒颗粒能借助包膜糖蛋白与靶细胞膜上的特异受体相结合,并将其遗传物质导入,外源基因即可以整合到靶细胞基因组中,并随着细胞的分裂而传给后代,使靶细胞成为稳定表达目的基因的转化细胞NeoR 基因是目前常用的标记基因,本实验通过新霉素筛选出5个阳性克隆,获得了稳定转染体,病毒滴度最高达2.05×104cfu/ml本实验构建了含Tum5基因的逆转录病毒载体,并获得了产毒细胞系这种假病毒颗粒作为Tum5基因转导到肿瘤生物治疗的一种前体，可为肿瘤治疗创建一种全新的“肿瘤基因治疗抗血管生成”疗法。

参考 文献 】 1 Maeshima Y，Colorado PC，Torre，A,et al.Distinct antitumor properties of a type Ⅳ collagen domain derived from basement membrane〔J〕.J Biol Chem，2000；275(28)：213408.2 Hamano Y ，Zeisberg M ，Sugimoto H，et al.Physiological levels of tumstatin，a fragment of collagen Ⅳ α3 chain，are generated by MMP9 proteolysis and suppress angiogenesis via αVβ3 integrin〔J〕.Cancer Cell，2003；3(6):589601.3 Floquet N，Pasco S，Ramont L,et al.The Antitumor properties of the 3(Ⅳ)(185203) peptide from the NC1 domain of type Ⅳ collagen (tumstatin) are conformationdependent 〔J〕.J Biol Chem，2004；279(3):2091100.4 王淑静,刘兴汉. 肿瘤抑素的研究进展〔J〕.生命的化学,2004;24(2)：12830.5 段小军，杨 柳，周 跃，等.荧光蛋白表达对小鼠成纤维细胞系NIH3T3体外增殖能力的影响〔J〕.中华烧伤杂志，2005；21（5）：3747.6 王有为，宋玉光，胡火珍，等.增强型绿色荧光蛋白表达对鼠C6细胞生物学特征影响的研究〔J〕.四川大学学报，2006；43（3）：65560.。