RealTimeRTPCR常见问题分析.doc

Real-TimeRT-PCR常见问题分析i. 某一孔荧光信号特别强问题：同一批样品，其中某一个荧光信号特别强？原因：①试剂配制时反应液没完全溶化，导致探针量在一管中增多；②试剂配制时没有充分混匀致各管中各成分的量不同；③也可能是PCR仪热槽被荧光物质污染，这时就要清除热槽中的污染；2. 扩增曲线有一向上或向下的尖峰D-一Y•・一X问题：扩增曲线有一向上或向下的尖峰？原因：①反应过程中电压不稳定；②可能在20循环左右仪器有停下或者仪器有开盖，使得光线突然增强；③如果尖峰向下，也可能是卤素灯老化所致，这时应更换；3. 部分样本扩增效率过低问题：部分样本扩增效率过低？原因：①提取液残留，一定程度抑制了PCR反应；②反应液未严格取量混匀或分装不均匀；③试剂失效；4. 阴性对照或空白对照翘尾，可能原因：1、模板提取环境有污染2、模板提取操作有污染3、配液过程存在污染问题：阴性对照或空白对照翘尾？原因：①模板提取环境有污染；②模板提取操作有污染；③试剂配制过程存在污染;5. 直线型扩增曲线问题：直线型扩增曲线？原因：①探针部分降解（探针降解原因：a.探针反复冻融一一稀释的探针可在4°C保存至少3个月，应避免反复冻融；b.探针在光线下暴露时间太长）；②反应液中有PCR抑制物；6. 没有扩增曲线AmpPlotComponent问题：没有扩增曲线？原因：①PCR参数设置错误，在设计循环参数时将荧光信号读取时间设在反应的第一步，即stage1阶段；②电脑设定了自动休眠；7.基线下滑基线下滑lEHEtBT!I二・lhlklWJ"JU2-Cl*luuiLGnmholiiirp」・：冲fikri-sB*p«Lb!*KhmuiIEaihLLuGUffl![*问题：扩增曲线有一个下滑阶段？原因：基线选取范围不对，可试着将基线范围改大一些，这一问题常因试剂质量所致;&扩增曲线断裂问题：扩增曲线断裂？原因：基线选取范围不对，基线终点大于Ct值，这通常是由于模板DNA浓度过高所致，因Ct值V15，而基线范围仍取3—15，其中包含部分扩增信号，导致标准差偏大，阈值过高，解决办法：减少基线终点至Ct值前4个循环，重新分析数据9•样品浓度跨度过大样品浓度过高，至阳性样品扩增曲线在后面循环中呈一向下的直线，原因及解决办法同“扩增曲线断裂”10.山坡形曲线问题：山坡形曲线？原因：常因反应管封口不严，至反应液蒸发所致。