hif-1α反义寡核苷酸对宫颈癌hela细胞生长抑制作用及hif-1α、vegf表达影响.docx

ＨＩＦ．１ａ反义脱氧寡核苷酸对宫颈癌Ｈｅｌａ细胞生长的抑制作用及ＨＩＦ．１ａ、ＶＥＧＦ表达的影响硕士研究生：于海华指导教师：韩璐教授专业名称：妇产科学摘要背景：近年来，反义技术广泛地应用于肿瘤基因治疗的研究中，随着基因组学、蛋白组学的研究，已筛选出部分在肿瘤转化、发展过程中的靶基因可作为治疗的靶标有学者发现，缺氧诱导因子．１ａ（ＨＩＦ．１ａ）是介导肿瘤细胞缺氧适应的关键性转录调控因子，在多种恶性实体瘤中高表达ＨＩＦ．１ａ可调节多种靶基因如血管内皮生长因子（ＶＥＧＦ）、红细胞生成素（ＥＰＯ）等的表达，维持肿瘤细胞的能量代谢，影响新血管的生成，促进肿瘤的增殖和转移血管内皮生长因子（ＶＥＧＦ）在内皮生长及肿瘤发生中具有重要作用，肿瘤的生长和扩散转移与血管生成密切相关因此，ＨＩＦ．１ａ可能是肿瘤基因治疗中一个极具潜力的靶点目的：应用ＨＩＦ—ｌａ反义脱氧寡核苷酸（ＡＳＯＤＮ）来处理体外培养的宫颈癌Ｈｅｌａ细胞，研究反义脱氧寡核苷酸封闭ＨＩＦ一１Ｑ基因对体外宫颈癌Ｈｅｌａ细胞生长的抑制作用及对ＨＩＦ．１ｄ、ＶＥＧＦ表达的影响，力求为今后进行针对ＨＩＦ．１ｄ的妇科肿瘤基因治疗探寻一条新的可行途径方法：１、对体外培养的宫颈癌Ｈｅｌａ细胞进行转染。

实验分为ＨＩＦ一１ｎ反义脱氧寡核苷酸（ＡＳＯＤＮ）组、ＨＩＦ．１ｎ正义脱氧寡核苷酸（ＳＯＤＮ）组、脂质体对照组及空白对照组２、采用四甲基偶氮唑蓝（ＭＴＴ）法，检测ＨＩＦ一１ａＡＳＯＤＮ对体外宫颈癌Ｈｅｌａ细胞株增殖的影响３、应用间接免疫荧光技术检测ＡＳＯＤＮ组、ＳＯＤＮ组、脂质体对照组及空白对照组细胞ＨＩＦ．１Ｑ和ＶＥＧＦ的表达４、逆转录一聚合酶链反应（ＲＴ—ＰｅＲ）检测各组细胞ＨＩＦ—ｌＱ和ＶＥＧＦｍＲＮＡ的表达５、蛋白印迹（Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ）技术检测各组细胞ＨＩＦ—ｌａ和ＶＥＧＦ的蛋白表达ｔ了解ＨＩＦ－ｌａ基因的沉默效果６、所得数据应用ＳＰＳＳｌｌ．５统计分析软件进行分析结果：１、反义脱氧寡核苷酸（ＡＳＯＤＮ）转染后２４ｈＢｌ３对宫颈癌Ｈｅｌａ细胞发生明显的生长抑制作用，与正义脱氧寡核苷酸（ＳＯＤＮ）组、脂质体（ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥＴＭ２０００）对照组比较，抑制率差异有统计学意义（Ｐ均＜ｏ．０１）反义脱氧寡核苷酸（ＡＳＯＤＮ）对宫颈癌Ｈｅｌａ细胞的生长抑制作用呈现剂量依赖性，随药物浓度增加抑制作用增强２、ＲＴ．ＰＣＲ及Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ结果显示，ＡＳＯＤＮ处理组细胞ＨＩＦ．１ａ及ＶＥＧＦ基因表达与ＳＯＤＮ组、脂质体对照组及空白对照组比较，表达量明显降低，差异有统计学意义（Ｐ＜Ｏ．０５）。

结果表明ＡＳＯＤＮ特异性抑制了ＨＩＦ一１Ⅱ的基因表达３、间接免疫荧光技术检测ＨＩＦ．１旺在胞浆及胞核中均着色，而ＶＥＧＦ着色主要分布在胞浆ＡＳＯＤＮ处理组细胞ＨＩＦ．１缸及ＶＥＧＦ的荧光强度均明显弱于对照组，说明ＡＳＯＤＮ对ＨＩＦ—ｌａ及ＶＥＧＦ的表达有明显的抑制作用此结果与ＲＴ．ＰＣＲ及Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ的分析结果一致，进一步为ＡＳＯＤＮ对ＨＩＦ—ｌａ￥［ＩＶＥＧＦ的基因表达具有抑制作用提供了实验依据结论：１、ＨＩＦ．Ｉａ在胞浆及胞核中均表达，而ＶＥＧＦ仅在胞浆中表达２、脂质体转染ＨＩＦ．１ＡＳＯＤＮ具有明显抑制富颈癌Ｈｅｌａ细胞的增殖活性及下调ＨＩＦ．１ｏ、ＶＥＧＦ基因表达的作用３、ＨＩＦ．１ⅡＡＳＯＤＮ转染可以作为宫颈癌治疗的一种新思路关键词：宫颈肿瘤缺氧诱导因子一１Ｈｅｌａ细胞反义脱氧寡核苷酸血管内皮生长因子ＩｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆＨｅｌａｃｅｌｌｇｒｏｗｔｈａｎｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＨＩＦ－１ｎａｎｄＶＥＧＦｂｙａｎｔｉｓｅｎｓｅｏｌｉｇＯｄｅｘｙｎｕｃｌｅＯｔｉｄｅｔａｒｇｅｔｉｎｇｈｙｐｏｘｉａｉｎｄｕｃｉｂｌｅｆａｃｔｏｒｌａｇｅｎｅＭａｓｔｅｒｄｅｇｒｅｅｃａｎｄｉｄａｔｅ：ＹｕＨａｉｈｕａＳｕｐｅｒｖｉｓｏｒ：ＰｒｏｆｅｓｓｏｒＨａｒｔＬｕＭａｊｏｒ：ＧｙｎａｅｃｏｌｏｇｙａｎｄＯｂｓｔｅｔｒｉｃｓＡｂｓｔｒａｃｔＢａｃｋｇｒｏｕｎｄ：Ｒｅｃｅｎｔｌｙ，ａｎｔｉｓｅｎｓｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＷａＳｇｅｎｅｒａｌｌｙａｐｐｌｉｅｄｔｏｔｈｅｒｅｓｅａｒｃｈｏｆｔｕｍｏｕｒｇｅｎｅｔｈｅｒａｐｈｙ．Ｗｉｔｌｌｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｇｅｎｏｍｉ＇ｃｓａｎｄｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓＳｏｍｅｏｆｔａｒｇｅｔｇｅｎｅｗａｓｓｃｒｅｅｎｅｄｏｕｔｉｎｔｈｅｃｏｕｒｓｅｏｆｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎａｎｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｔｕｍｏｕｒ．ｓｏｍｅａｕｔｈｏｒｄｉｓｃｏｖｅｒｔｈａｔＨＩＦ－ｌａｍａｙｂｅｔｈｅｋｅｙｔｒａｎｓｌａｔｏｒ－ｆａｃｔｏｒｔｏａｄａｐｔｔｈｅｈｙｐｏｘｉａｃｏｎｄｉｔｉｏｎｆｏｒｍｏｓｔｃｅｌｌｓ，ＨＩＦ—ｌｅｔＷａＳｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｍｕｌｔｉｐｌｅｍａｌｉｇｎａｎｔｎｅｏｐｌａｓｍ．ＨＩＦ－ｌｅｔｃａｎｍｏｄｕｌａｔｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｍｕｌｔｉｐｌｅｔａｒｇｅｔｇｅｎｅｌｉｋｅｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ），ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ（ＥＰＯ）ａｎｄｓｕｓｔａｉｎｅｎｅｒｇｙｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｏｆｎｅｏｐｌａｓｍ，ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，ｐｒｏｍｏｔｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄｍｅｔａｓｔａｓｉｓｏｆｎｅｏｐｌａｓｍ．ＶＥＧＦｗａｓｉｍｐｏｒｔａｎｔｉｎｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈａｎｄｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ．Ｉｔｗａｓｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓａｎｄｇｒｏｗｔｈａｎｄｍｅｔａｓｔａｓｉｓｏｆｔｕｍｏｕｒ．ＳｏＨＩＦ—ｌａｍａｙｂｅｐｏｔｅｎｔｉａｌｔａｒｇｅｔｆｏｒｔｕｍｏｕｒｇｅｎｅｔｈｅｒａｐｙ．Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｓｔｕｄｙｉｎｈｉｂｉｔｉｖｅｅｆｆｅｃｔｏｆＨＩＦ－ｌｅｔｆｕｌｌｙｐｈｏｓｐｏｒｏｔｈｉｏａｔｅｄａｎｔｉｓｅｎｓｅｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ（ＨＩＦ－ｌｅｔＡｓ０ＤＮｌｏｎｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＨＩＦ—ｌｓａｎｄＶＥＧＦａｎｄｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆｃｅｒｖｉｃａｌｃａｎｃｅｒＨｅｌａｃｅｌｌｌｉｎｅｉｎｖｉｔｒｏ．Ｔ１１ｉｓｓｔｕｄｙｗｉｌｌｈｅｌｐｔｏｉｄｅｎｔｉｆｙＨＩＦ—ｌｅｔａｓａｎｅｗｔａｒｇｅｔｆｏｒｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃｔｕｍｏｒｇｅｎｅｔｈｅｒａｐｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：１．ＨｅｌａｃｅｌｌｌｉｎｅｗｅｒｅｗｅｒｅｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｂｙＡＳＯＤＮａｎｄＳＯＤＮｗｉｔｈｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２０００ｒｅａｇｅｎｔ．ＴｈｅｒｅｗｅｒｅｆｏｕｒｇｒｏｕｐｓｉｎｔｈｉｓｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｗｈｉｃｈｗａｓＡＳＯＤＮ，ＳＯＤＮ，ｌｉｐｓｏｍａｌａｎｄｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ．２．Ｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｃｅｒｖｉｃａｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ（ＭＴＴ）．ｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｔｙｌｃａｎｃｅｒＨｅｌａｃｅｌｌｓｗａｓｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｕｓｉｎｇ３．１１１ｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＨＩＦ－ｌａａｎｄＶＥＧＦＷａＳｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ，ＲＴ－ＰＣＲａｎｄｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ．ＨＩＦ—ｌａｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇｗａｓｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ．４．ＵｓｉｎｇＳＰＳＳ１１．５ｓｏｆｔｗａｒｅｔｏａｓｓａｙｔｈｅｄａｔａ．３Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｉ．ＴｈｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｒａｔｅｓｏｎｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆＨｅｌａｃｅｌｌｓｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｂｙＡＳＯＤＮｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｏｓｅｏｆｃｏｎｔｒｏｌ，ＳＯＤＮ，ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ１Ｍ２０００ａｎｄｂｌａｎｋｇｒｏｕｐ（ａｌｌ尸＜０．０５）ｗｉｔｈｄｏｓｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ．２．ＴｈｅｍＲＮＡａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＨＩＦ－ｌａａｎｄＶＥＧＦｉｎｃｅｒｖｉｃａｌｃａｎｃｅｒＨｅｌａｃｅｌｌｓｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｏｗｎｒｅｇｕｔａｔｅｄｂｙＨＩＦ—ｌａＡＳＯＤＮｆａｌｌＰ＜０．０５）．ＴｈｅＳＯＤＮａｎｄｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２０００ｓｈｏｗｅｄｎｏｓｕｃｈｅｆｆｅｃｔ（Ｐ＞０．０５）．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｉｎｄｉｃａｔｅｄＡＳＯＤＮｉｎｈｉｂｉｔｅｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＨＩＦ—ｌａｗｉｔｈｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．３．ＩｎｄｉｒｅｃｔｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＨＩＦ－ｌａａｎｄＶＥＧＦ．ＨＩＦ—ｌａｗａｓｓｔａｉｎｉｎｇｉｎｔｈｅｎｕｃｌｅａｒａＩｌｄｃｙｔｏｐｌａｓｍａｎｄＶＥＧＦｗａｓｓｔａｉｎｉｎｇｏｎｌｙｉｎｔｈｅｃｙｔｏｐｌａｓｍ．ＴｈｅｆｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｉｎｔｅｎｓｉｔｙＷａＳｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｓｕｂｄｕｅｄｂｙＨＩＦ＿ｌａＡＳＯＤＮｔｈａｎｏｔｈｅｒｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐｓ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｗａｓｄｃｔｅｃｔｅｄｔｈａｔｃｏｎｆｏｒｍｅｄｔｏｐｒｅｖｉｏｕｓｍｅａｓｕｒｅ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：１．ＨＩＦ—ｌａＷａｓｓｔａｉｎｉｎｇｉｎｔｈｅｎｕｃｌｅａｒｉｎｔｈｅｃｙｔｏｐｌａｓｍ．ａｎｄｃｙｔｏｐｌａｓｍａｎｄＶＥＧＦｗａｓｓｔａｉｎｉｎｇｏｎｌｙ２．ＨＩＦ—ｌａａｎｔｉｓｅｎｓｅｏｌｉｇｏｄｅｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＣａｌｌｏｂｖｉｏｕｓｌｙｉｎｈｉｂｉｔｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＨＩＦ一１口ａｎｄＶＥＧＦｉｎＨｅｌａｃｅｌｌｓ．３．ＨＩＦ—ｌａＡＳＯＤＮｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎｍｉｇｈｔｂｅｃｅｒｖｉｘｃａｒｃｉｎｏｍａ．ａｎｉｍｐｏｇａｎｔｎｅｗｔｒｅａｔｍｅｎｔｆｏｒｕｔｅｒｉｎｅＫｅｙｗｏｒｄｓ：ｕｔｅｒｉｎｅｃｅｒｖｉｘｃａｒｃｉｎｏｍａＨｅｌａｃｅｌｌｓＶＥＧＦＨＩＦ一１ｓ４ａｎｔｉｓｅｎｓｅｏｌｉｇｏｄｅｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＨＩＦ．１ａ反义脱氧寡核苷酸对宫颈癌Ｈｅｌａ细胞生长的。