第六章-金黄色葡萄球菌的检验学习资料.ppt

第六章金黄色葡萄球菌检验 雪印牛奶中毒事件 人民日报 记者于青管克江 报导6月底以来 日本关西等地区发生特大食品中毒事件 截至6月30日晚间 因喝下有问题的雪印牌低脂肪牛奶而产生上吐下泻 腹痛等不适症状的患者人数为4891人 到7月1日中午 中毒人数已经超过5000人 且受害范围也由原来的5个行政区域扩大至8个 这是战后日本发生的规模最大的一起食品中毒事件 7月2日 大阪府公共卫生研究所证实 从患者饮用剩余的雪印牛奶中检查出了金黄色葡萄球菌 这种葡萄球菌导致A型肠毒素滋生 该毒素可造成饮用者腹泻 呕吐及全身不适 牛奶被污染原因何在 金黄色葡萄球菌的显微照片典型的金黄色葡萄球菌为球型 直径0 8mm左右 显微镜下排列成葡萄串状 金黄色葡萄球菌革兰氏染色显微照片金黄色葡萄球菌无芽胞 鞭毛 大多数无荚膜革兰氏染色阳性 金黄色葡萄球菌的扫描电镜照片StaphylococcusaureusEnhancedsemw 7 9micron 金黄色葡萄球菌的透射电镜照片Temx12000digitizedStaphylococcusaureus 2 培养特性 金黄色葡萄球菌营养要求不高 在普通培养基上生长良好 加少量葡萄糖或血液生长更旺盛 需氧或兼性厌氧 最适生长温度37 最适生长pH7 4金黄色葡萄球菌有高度的耐盐性 可在7 5 15 NaCl肉汤中生长 3 生化特性 可分解葡萄糖 麦芽糖 乳糖 蔗糖 产酸不产气 甲基红反应阳性 VP反应弱阳性 许多菌株可分解精氨酸 水解尿素 还原硝酸盐 液化明胶 金黄色葡萄球菌具有较强的抵抗力 对磺胺类药物敏感性低 但对青霉素 红霉素等高度敏感 金黄色葡萄球菌的致病性金黄色葡萄球菌的致病力强弱主要取决于其产生的毒素和侵袭性酶 a 溶血毒素 外毒素 分 能损伤血小板 破坏溶酶体 引起肌体局部缺血和坏死 b 杀白细胞素 可破坏人的白细胞和巨噬细胞 c 血浆凝固酶 当金黄色葡萄球菌侵入人体时 该酶使血液或血浆中的纤维蛋白沉积于菌体表面或凝固 阻碍吞噬细胞的吞噬作用 葡萄球菌形成的感染易局部化与此酶有关 d 脱氧核糖核酸酶 金黄色葡萄球菌产生的脱氧核糖核酸酶能耐受高温 可用来作为依据鉴定金黄色葡萄球菌 e 肠毒素 金黄色葡萄球菌能产生数种引起急性胃肠炎的蛋白质性肠毒素 分为A B C D E及F六种血清型 金黄色葡萄球菌肠毒素是个世界性卫生问题 在美国由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒占整个细菌性食物中毒的33 加拿大则更多 占45 我国每年发生的此类中毒事件也非常多 肠毒素形成条件 存放温度 在37 内 温度越高 产毒时间越短 存放地点 通风不良氧分压低易形成肠毒素 食物种类 含蛋白质丰富 水分多 同时含一定量淀粉的食物 肠毒素易生成 当金黄色葡萄球菌污染了含淀粉及水分较多的食品 如牛奶和乳制品 肉 蛋等 在温度条件适宜时 经过8 10小时即可产生相当数量的肠毒素 肠毒素可耐受100 煮沸30分钟而不被破坏 人摄食该菌污染的食物2 3h后可引起中毒症状 它引起的食物中毒症状是呕吐和腹泻 金黄色葡萄球菌的流行病学特点季节分布 多见于春夏季 中毒食品种类多 如奶 肉 蛋 鱼及其制品 此外 剩饭 油煎蛋 糯米糕及凉粉等引起的中毒事件也有报道 GB4789 10 2010 第一法 金黄色葡萄球菌的定性检测 第二法 金黄色葡萄球菌Baird Parker平板计数 第三法 金黄色葡萄球菌MPN计数 金黄色葡萄球菌的检验 金黄色葡萄球菌的定性检验 检样 增菌 7 5 氯化钠肉汤或10 氯化钠胰酪胨大豆肉汤 BP平板 血平板 涂片染色 观察溶血 BHI肉汤和营养琼脂 血浆凝固酶实验 报告 金黄色葡萄球菌的检验1 样品制备按无菌操作取检样25g mL 加入225mL灭菌生理盐水 固体样品研磨或置均质器中制成1 10样品混悬液 供计数检验时 可按十进位递增稀释法将样品匀液再进行适当稀释 金黄色葡萄球菌的检验2 增菌及分离培养吸取5mL混悬液 接种于7 5 氯化钠肉汤或胰酪胨大豆肉汤50mL培养基内 36 1 培养24h 转种血平板和Baird Parker平板 36 1 培养24h 挑取血平板上金黄色 有时为白色 菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验 血平板上金黄色葡萄球菌菌落形态金黄色葡萄球球菌的单个菌落在血平板上呈金黄色 有时也为白色 大而突出 圆形 不透明 表面光滑 周围有溶血圈 金黄色葡萄球菌在BP平板上的菌落形态在Baird Parker琼脂平板上菌落呈圆形 表面光滑 凸起 湿润 直径2 3mm 灰黑色至黑色 有光泽 常有浅色 非白色 的边缘 周围绕以不透明圈 沉淀 其外常有一清晰带 当用接种针触及菌落时具有黄油样粘稠感 有时可见到不分解脂肪的菌株 除没有不透明圈和清晰带外 其他外观基本相同 从长期贮存的冷冻或脱水食品中分离的菌落 其黑色常较典型菌落浅些 且外观可能较粗糙 质地较干燥 成分 胰蛋白胨牛肉膏酵母膏丙酮酸钠甘氨酸氯化锂卵黄亚碲酸钾琼脂 BP平板主要成分及作用 氯化锂 甘氨酸抑制非致病性葡萄球菌的生长丙酮酸钠促进葡萄球菌生长亚碲酸钾抑制G 杆菌生长 可被金黄色葡萄球菌还原为碲盐呈黑色卵黄含蛋白质 卵磷脂 脂肪 提供营养和有利于观察卵磷脂环 金黄色葡萄球菌在甘露醇盐平板上的菌落Staphylococcusaureusonmannitolsaltsagar 3 血浆凝固酶试验 吸取1 4新鲜兔血浆0 5mL 放入小试管中 再加入培养24h的金黄色葡萄球菌肉浸液肉汤培养物0 5mL 振荡摇匀 置36 1 温箱或水浴内 每半小时观察一次 观察6h 如呈现凝固 即将试管倒置或倾斜时 呈现凝块者 被认为阳性结果 同时以已知阳性和阴性葡萄球菌株及肉汤作为对照 金黄色葡萄球菌肠毒素的检测一 动物学试验主要用幼猫和猴 二 血清学试验肠毒素作为抗原 可以和特异性抗体发生结合性反应 产生可见沉淀 用血清学反应检验金黄色葡萄球菌肠毒素 方法主要有 免疫琼脂扩散法反向间接血凝试验免疫荧光法酶联免疫吸附法 金黄色葡萄球菌快速检测方法目前 随着研究的深入 一些快速和采用现代技术的检测方法不断出现 这些新的快速方法 一般都缩短了传统检测方法的时间 能够较快地得到检测结果 并且操作相对简单 比如 法国梅里埃公司生产的RPF培养基 API检测系统等 梅里埃公司生产的miniVIDAS利用荧光免疫的方法检测葡萄球菌肠毒素 在仪器上45min可以得到结果 法国梅里埃公司生产的RPF培养基 凝固酶阳性葡萄球菌 菌落周围形成沉淀圈 例 金黄色葡萄球菌 将兔血浆包括在培养基中作为直接确认菌落的手段 金黄色葡萄球菌污染的控制防止食品污染防止带菌人群对各种食物的污染 定期对生产加工人员进行健康检查 患局部化脓性感染 如疥疮 手指化脓等 上呼吸道感染 如鼻窦炎 化脓性肺炎 口腔疾病等 的人员要暂时停止其工作或调换岗位 金黄色葡萄球菌污染的控制防止食品污染防止金黄色葡萄球菌对奶及其制品的污染 如牛奶厂要定期检查奶牛的乳房 不能挤用患化脓性乳腺炎的牛奶 奶挤出后 要迅速冷至 10 以下 以防毒素生成 细菌繁殖 奶制品要以消毒牛奶为原料 注意低温保存 对肉制品加工厂 患局部化脓感染的禽 畜尸体应除去病变部位 经高温或其他适当方式处理后进行加工生产 防止金黄色葡萄球菌肠毒素生成应在低温和通风良好的条件下贮藏食物 以防肠毒素形成 在气温高的春夏季 食物置冷藏或通风阴凉地方也不应超过6小时 并且食用前要彻底加热 。