免疫分型教程.doc

40-免疫分型教程（i）上图是正常骨髓经CD45、CD71、CD33染色后组成的CD45/SSC、CD71/CD33双参数散点图；通过这两个组合，能够分辨骨髓的正常细胞、检查是否有异常细胞存在、评估细胞的成熟情况CD45/SSC图中可见：1, CD45强阳性SSC低信号的细胞群为淋巴细胞（褐色细胞群体）；2，中等强度的CD45表达，SSC信号最强的细胞群体为粒细胞（蓝色及红色细胞群体）；3,CD45表达与SSC信号介于淋巴细胞与粒细胞之间的是单核细胞群体（绿色细胞群体）；4，CD45阴性，SSC信号最低的有核红细胞和细胞碎片；CD33/CD71图中可见：1, CD33表达最强的单核细胞群体（绿色）；2, 粒细胞CD33表达较单核弱，不成熟粒表达CD71，成熟后不表达3, 淋巴细胞、有核细胞和细胞碎片不表达CD33、CD71CD11B/CD15图可用来评估髓系细胞向单核、粒分化的程度（随着髓细胞成熟，细胞逐步获得CD11B,粒细胞高表达CD15）：1, 单核细胞（绿色）高表达CD11B,CD15中等到表达；2, 粒细胞（蓝色及橘红色）高表达CD15,蓝色成熟粒CD11B表达较橘红色不成熟粒细胞强，幼稚髓细胞仅表达CD15而无CD11B。

3, T、B淋巴细胞不表达CD15、CD11B,NK细胞表达CD11B而无CD15（红色细胞）4, 有核红细胞及碎片不表达CD15和CD11B根据骨髓细胞CD45/SSC图中分布情况设门圈定各类细胞R1门为成熟淋巴细胞；R2门为正常单核细胞位置；R3门正常粒细胞位置；R4门为幼稚淋巴细胞出现位置；R5门为有核红细胞或细胞碎片位置；R6门为幼稚髓细胞出现位置；白血病细胞通常会在R4、R6两门位置处出现MO免疫分型M0:急性髓细胞白血病微分化型原始细胞在光镜下类似L2型细胞，核仁明显，胞浆透明，嗜碱性,无嗜天青颗粒及Auer小体，髓过氧化酶(MPO)及苏丹黑B阳性细胞＜3%;电镜下,MPO(+);CD33或CD13等髓系标志可呈(+)，淋巴系抗原通常为(-)，但有时CD7+,TdT+;部分急非淋白血病可表现CD7+，TdTo形态学：幼稚细胞占骨髓有核细胞90%以上；肿瘤细胞不出现AUER小体；粒细胞缺少，MPO或苏单黑染色阴性遗传学：染色体常有复杂的异常，特别是5和7号染色体当病例伴T(9；22)时会出现淋系抗原幼稚细胞群体的FS和SS信号低，在CD45/SS点图中特征性地与幼稚淋巴细胞区域相连。

幼稚细胞至少表达一种骨髓抗原：CD13,CD33,但完全缺乏髓系成熟分化抗原：CD11B,CD15和CD16相当一部分病例TDT阳性，但在肿瘤细胞上分布不均肿瘤细胞通常淋系抗原阴性，但有时也会表达CD7或CD4；HLA-DR通常阳性，CD34则为阴性有学者指出伴CD7和CD34同时表达的病人预后不佳检测胞浆内MPO比CD33/CD13联合检测更为敏感M0中MPO阳性率一般小于3%，如大于3%则要判定为MlM0:HLA-DR+,CD34+,CD13+/-,MP0+,CD14-,CDllb-,TdT-/+to+/-1023SDDODD400ID2IDIDCD4520010_□21D-LDC51UII~I~I111||II~I11I||II~II11I||II~II11||1C°1011C210°10dCB34骨髓样本类似纯化的培养细胞，在CD45/SSC图中可见到数量占绝大多数的一群幼稚细胞群体这群异常细胞在的SSC信号较低，大小中等幼稚细胞CD19、CD34阴性，但同时表达CD13和CD33CD13表达稍弱，且抗原表达较CD33不均一白血病细胞占了所有细胞群体的96%HLA-DR在这些髓系细胞上不表达。

这些幼稚细胞表型的情况是：CD13阳性，CD33阳性，CD34阴性，HLA-DR阴性这个表型与AML-M3相以IDID1010CD11710°1M10^10°,.10°1D1ID21Da10iCDS肿瘤细胞不表达CD71、CD117、CD18、CDllb和CD15CD64是阴性，但CD14表达CD14表达强度比较弱与CD13相似T细胞标志物CD2、CD5、CD3和CD7都不表达在图中可观察到残存的一些T细胞与阴性对照相比，CD4弱阳性表达诊断：AML微分化型，CD34和HLA-DR阴性实验室进一步诊断：MPO(免疫组化)阳性,NSE阴性，46XY，t(3;5)(q25;q34)重要说明：本例中白血病细胞免型表型为：CD34-、HLA-DR-,CD13+,CD33++,表面看与AML-M3相似在许多幼稚细胞胞浆内存在的颗粒会导致AML-M3的误诊但FCM的数据提供了一些有价值的信息避免这个错误具体总结如下：（1）表达CD14（克隆号leu-M3）,尽管表达有所降低；（2）SSC信号降低并且相对分散这一点十分重要，因为AML-M3V的SSC信号比较集中，甚至M3v细胞中带有颗粒另一重要信息是CD13表达下降甚至缺失而CD33强阳性（一种异常的CD13/CD33表达模式）。

有时AML-M3可能会缺失表达CD13对于这些疑难病例需要借助分子遗传学和细胞遗传学诊断工具来建立正确的诊断10|"'I□cl_b110°W1计TDTF1TC其他标记物如：Bcells（CD19,CD20,Kappa,Lambda）,CDlO（Calla）,CD5（Tcells）,CD41（platelet）都是阴性光散射图中显示在前向散射光和表示颗粒度的侧向散射光有一群处于中间位置的细胞这与组织学检测结果相一致暂无图）将光散射图中的异常细胞放置于CD45/CD14上显示发现CD45阳性并CD14阴性（99%）CD45表达强度低于成熟淋巴细胞，可能是由髓系细胞和未成熟幼稚细胞组成暂无图）在HLADR/CD3等高图中发现其中大部分DR阳性（81%）并且CD3阴性（T细胞受体）这个表型可见于活化的T细胞和成熟B细胞（CD45强阳性）DR表达于绝大多数髓系细胞、B细胞和活化的T细胞CD34/CD38图中显示细胞CD34阴性并且CD38阳性CD38可见到浆细胞、前B细胞、单核细胞、ALL细胞和绝大多数AML细胞此处可排队浆细胞的可能性（CD45阴性），前B细胞还无法排除，单核细胞可排除（CD14阴性）。

CD13/CD15等高图中显示大部分细胞（63%）髓系抗原CD13/CD15阴性但此处提供了一丝线索，因为有些细胞（30%）表达低水平CD15绝大部分AMLM1-M6细胞同时表达CD13和CD15从CD33/TdT图中可以肯定这些细胞源自髓系（CD33阳性）无细胞表达TdT这表明这些细胞是处于极早期的髓系细胞，可能AML-M0/M1CDllb/GPA双参数图中也证实了这些细胞早期髓系的属性GPA在这些细胞上弱表达这种情况可见于早期髓系干细胞CDllb可见于单核细胞、粒细胞，NK细胞不表达此抗原这些细胞还同时表达CD7这使人感觉有误，但现已知早期髓系白血病细胞可偶然同时表达CD7将这些结果综合来看支持M0或Ml的诊断要用流式细胞仪来区分M0和Ml现还有困难所以还要结合组织学检测的结论，如发现有MPO阳性则支持M1，如阴性则为M0M1免疫分型CD45PERCP幼稚细胞成群，RALS信号弱Ml与M0很难区分，但Ml细胞大小及颗粒度较MO稍大，与原粒细胞接近至少伴随一种髓系抗原：CD13或CD33101101CD7FITC1D1£:二OL豆01-a高表达HLA-DR,CD34阳性但较MO弱，〉3%的幼稚细胞表达MPO,较M0多。

不表达CD11B,CD15,CD16等Ml:CDllB-/+,HLA-DR+,CD13+,CD33+,CD34+,CD14+,MP0+,TdT-/+to+/-M2免疫分型1011D2101CO45PERCPCSL上口心工-3韶CD45/RALS图中细胞分布广泛与Ml不同，这是因为M2细胞已进一步分化幼稚细胞减少，粒细胞增多并与BLASTWINDOWS区域内细胞相连因细胞没有明显分群，很难将异常细胞与正常相区分，故设立多个门进行分析检测其成熟度抗原的表达情况M2免疫表型与M1类似，HLA-DR，CD33,CD13阳性上图中可见幼稚细胞CD33与CD71表达均比成熟粒细胞强CD13表达强于CD33Ludm二8101102CD15F1TCIQ1M2肿瘤细胞弱表达CD15与CD11B,说明细胞已分化CD34表达显著降低M2肿瘤细胞不表达CD5,CD7和TdT等抗原，如病例伴t(8;21),则经常表达CD19偶表达CD56一般肿瘤细胞MPO强阳性偶见形态为M2并伴t(8;21)，但CD13-，CD33-，CD14-，而MPO+八U!=：••••0-1_!_,'V',_!_,_!_!_,_!_!_,_!_!_,_!_!_,_!_!_,_!_!_,_j-J01023FSC-Height细胞分布广泛，幼稚细胞较Ml少。

CD13和CD33阳性，且CD13表达高于CD33HLA-DR阳性，CD15弱阳性OCD10rITC：M2肿瘤细胞伴t(8,21)CD19阳性M3免疫分型01023FSC-Ha^rt上图为M3V,少颗粒型早幼粒白血病细胞，细胞中颗粒少RALS信号低而集中，SS座标上出现大量肿瘤细胞肿瘤细胞大，FS信号强通过CD45/RALS双参图可辨别出M3与M3V下为经典M3多颗粒细胞的CD45/RALS和SS/FS图M3与M3V在免疫表型上无区别O.._|l'io1To1ioJ1呼CD34F1TCM3肿瘤细胞特征性地不表达髓系早期标志物CD34和HLA-DR；部分病例中CD9特征性地阳性，但不是完全特异CD2在M3与M3V中会出阳性表达，在HLA-DR阴性的病例中，与染色体t(15,17)异常相关肿瘤细胞CD33表达比正常粒细胞强与正常单核细胞相似，CD13表达多样肿瘤细胞不表达晚期髓细胞分化抗原CD15，CD16和CD11B肿瘤细胞完全不表达CD15，与正常早幼粒细胞表达CD15相区别；正常早幼粒细胞细胞周期中含高比例S期细胞，而肿瘤细胞中几乎不见细胞周期OL□_二宀二二二I::lws-=]-_idciL6Lud兰隹出0h<11011011D1mpoFrrcCYTOPLASMIC肿瘤细胞MPO阳性，上图中MPO与LACTOFERIN双染来区分成熟粒细胞。

肿瘤细胞除表达CD2外，很少表达T或B系抗原M3肿瘤细胞因其胞浆内多颗粒，细胞具有很。