促红细胞生成素课件.ppt

基因工程基因工程(jīyīn gōngchéng)药物药物——促红细胞生成素促红细胞生成素（（EPO））第一页，共十八页促红细胞生成素EPO的概念的概念EPO的的用途用途及其及其疗疗效效EPO的的纯纯化化历历史史及及工工艺艺流程流程EPO的的销销售情售情情况情况及其及其前景前景第二页，共十八页促红细胞生成素什么(shén me)是EPO？œEPO：是促红细胞生成素（：是促红细胞生成素（Erythropoietin）的英文简称的英文简称 œ促红细胞生成素：最初是从肾脏中分离出来能刺激前体红促红细胞生成素：最初是从肾脏中分离出来能刺激前体红细胞增生、分化的一种细胞因子细胞增生、分化的一种细胞因子œ人体血液中的促红细胞生成素：是由肾脏和肝脏分泌人体血液中的促红细胞生成素：是由肾脏和肝脏分泌(fēnmì)的一种激素样物质，能够促进红细胞生成它与的一种激素样物质，能够促进红细胞生成它与其受体其受体(EPO-R)结合后共同介导缺氧的生理反应结合后共同介导缺氧的生理反应第三页，共十八页促红细胞生成素EPO的用途的用途(yòngtú)™医疗用途：增加红血球的数目，用于贫血、医疗用途：增加红血球的数目，用于贫血、组织断离、早产儿，用在癌学和血液学方面。

组织断离、早产儿，用在癌学和血液学方面™体育用途体育用途(兴奋剂兴奋剂)：增加训练耐力和训练负荷：增加训练耐力和训练负荷(fùhè)，属于国际奥委会规定的违禁药物在，属于国际奥委会规定的违禁药物在2008年北京奥运会中第一例的兴奋剂　年北京奥运会中第一例的兴奋剂　第四页，共十八页促红细胞生成素EPO的的 疗效疗效(liáoxiào)™1、肾性贫血患者、肾性贫血患者EPO水平较低，在进行治疗过程中，往往水平较低，在进行治疗过程中，往往通过注射通过注射EPO来提高体内来提高体内EPO水平进行治疗，从而帮助水平进行治疗，从而帮助(bāngzhù)病人增加红细胞数量，此时病人增加红细胞数量，此时EPO水平有所上升水平有所上升™2、其他贫血如缺铁性贫血、巨细胞性贫血患者、其他贫血如缺铁性贫血、巨细胞性贫血患者EPO水平不水平不降低，但也可以使用降低，但也可以使用EPO治疗，此时浓度也会有所升高治疗，此时浓度也会有所升高™3、再生障碍性贫血和骨髓造血功能不全患者、再生障碍性贫血和骨髓造血功能不全患者EPO水平水平升高第五页，共十八页促红细胞生成素EPO的纯化的纯化(chún huà)历史历史Ø1、、Miyake的七步法：纯化步骤太多，对设备及操作要求的七步法：纯化步骤太多，对设备及操作要求也较高，不适合工业生产的特点。

也较高，不适合工业生产的特点Ø2、、Spivik利用凝集素亲和层析纯化利用凝集素亲和层析纯化EPO：由于凝集素亲和：由于凝集素亲和层析凝胶易被杂蛋白不可逆吸附，使得分离效果降低，成本层析凝胶易被杂蛋白不可逆吸附，使得分离效果降低，成本增高，也不利于大规模生产增高，也不利于大规模生产Ø3、近年来则利用三步层析、近年来则利用三步层析(cénɡ xī)法三步纯化基本流程法三步纯化基本流程 等第六页，共十八页促红细胞生成素EPO的工艺流程的工艺流程(ɡōnɡ yì liú chénɡ)——①①三步层析法三步层析法ØØ1、、 染料配基亲和层析染料配基亲和层析(cénɡ xī)(cénɡ xī)→反相疏水层析反相疏水层析(cénɡ xī)(cénɡ xī)→离子交换层析离子交换层析(cénɡ xī)(cénɡ xī);ØØ2、、 染料配基亲和层析染料配基亲和层析→反相疏水层析反相疏水层析→分子分子筛层析筛层析;ØØ3、、 反相疏水层析反相疏水层析→离子交换层析离子交换层析→分子筛层分子筛层析第七页，共十八页促红细胞生成素EPO的工艺流程的工艺流程(ɡōnɡ yì liú chénɡ)——②②三步纯化基本流程三步纯化基本流程ØØ第一步：反相柱色谱第一步：反相柱色谱 样品浓缩样品浓缩(nónɡ suō)(nónɡ suō)约约96.7%ØØ透析透析ØØ第二步：第二步： DEAE-离子交换色谱离子交换色谱ØØ第三步：第三步： 分子筛色谱分子筛色谱 总回收率总回收率总回收率总回收率 〉〉〉〉30%30% 比活比活比活比活 1.5*10 1.5*108 8U/g蛋白蛋白第八页，共十八页。

促红细胞生成素第一步：反相色谱第一步：反相色谱vvC6 反相柱（反相柱（2cm*2cm）） （创新生物技术（创新生物技术(jìshù)(jìshù)公司）公司）vv流程：流程： 上样上样上样上样 50ml/min 50ml/min（柱结合量约（柱结合量约（柱结合量约（柱结合量约5mg5mg蛋白蛋白蛋白蛋白/ml/ml介质介质介质介质) ) 去离子水去离子水去离子水去离子水平衡至检测基线平衡至检测基线平衡至检测基线平衡至检测基线 10%~80%10%~80%乙醇胍乙醇胍乙醇胍乙醇胍线性梯度洗脱线性梯度洗脱线性梯度洗脱线性梯度洗脱 检测并收集含检测并收集含检测并收集含检测并收集含EPOEPO主峰主峰主峰主峰 ELISA ELISA测定测定测定测定vv结果：结果：60%60%乙醇乙醇乙醇乙醇-1mol/L-1mol/L盐酸胍盐酸胍盐酸胍盐酸胍洗出洗出EPO第九页，共十八页促红细胞生成素透析透析vv透析液：透析液：10倍体积的倍体积的10mmol/L Tris.HCl (pH 7.5)-2%蔗糖缓冲液蔗糖缓冲液vv透析次数透析次数(cìshù)(cìshù)：：2vv时间：时间：5~6h第十页，共十八页。

促红细胞生成素第二步：离子交换第二步：离子交换(lí zǐ jiāo huàn)(lí zǐ jiāo huàn)柱柱vvDEAE型离子交换柱型离子交换柱vv流程：流程： 10mmol/L 10mmol/L Tris.HClTris.HCl(pH7.5)(pH7.5)缓冲液缓冲液缓冲液缓冲液平平平平 上样上样上样上样 20ml/min 20ml/min（柱结合量（柱结合量（柱结合量（柱结合量20mg/ml20mg/ml）））） 10mmol/L Tris.HCl(pH7.5) 10mmol/L Tris.HCl(pH7.5)缓冲液平衡缓冲液平衡缓冲液平衡缓冲液平衡至基线至基线至基线至基线 添加添加添加添加NaClNaCl入缓冲液，进行入缓冲液，进行入缓冲液，进行入缓冲液，进行截状梯度洗脱截状梯度洗脱截状梯度洗脱截状梯度洗脱（（（（NaClNaCl浓度浓度浓度浓度(nóngdù)(nóngdù)分别为：分别为：分别为：分别为：5050，，，，7070，，，，125mmol/L125mmol/L））））vv结果：结果： ELISA检测盒表明检测盒表明75mmol/L洗脱峰中洗脱峰中含含EPO第十一页，共十八页。

促红细胞生成素第三步：分子筛色谱第三步：分子筛色谱(sè pǔ)(sè pǔ)vvSephacryl S-200 色谱分析色谱分析vv流程：流程： 上样体积上样体积上样体积上样体积(tǐjī)(tǐjī) 80ml 80ml 流速流速流速流速 2ml/min 2ml/min 流动相流动相流动相流动相 20mmol/L 20mmol/L 柠檬酸钠柠檬酸钠柠檬酸钠柠檬酸钠- 100mmol/L NaCl- 100mmol/L NaCl 缓冲液缓冲液缓冲液缓冲液vv结果：结果：收集的收集的收集的收集的rHuEPOrHuEPO保留时间约为保留时间约为保留时间约为保留时间约为45min 45min 比比比比活性约为活性约为活性约为活性约为1.5*101.5*108 8U/gU/g蛋白；纯度蛋白；纯度蛋白；纯度蛋白；纯度 〉〉〉〉98%98%（（（（SDS-PAGESDS-PAGE检检检检测）测）测）测） 免疫原性检测：免疫原性检测：免疫原性检测：免疫原性检测：Western blotWestern blot第十二页，共十八页。

促红细胞生成素EPO的销售的销售(xiāoshòu)情况情况ª重组促红细胞生成素，也称超级重组促红细胞生成素，也称超级“重磅炸弹重磅炸弹”基因药物基因药物 ª1985年科学家应用基因重组技术，在实验室获得重组人年科学家应用基因重组技术，在实验室获得重组人EPO（（rhEPO），），1989年安进（年安进（Amgen）公司的第一个）公司的第一个基因重组药物基因重组药物Epogen获得获得FDA的批准，适应症为慢性肾的批准，适应症为慢性肾功能衰竭导致的贫血、恶性肿瘤或化疗导致的贫血、失血功能衰竭导致的贫血、恶性肿瘤或化疗导致的贫血、失血后贫血等，其市场后贫血等，其市场(shìchǎng)表现不俗，表现不俗，1999年销售值达到年销售值达到17.6亿美元，亿美元，2000年年19.6亿美元，亿美元，2002年年22.6亿美元，亿美元，2003年年24.4亿美元，成为名副其实的亿美元，成为名副其实的“重磅炸弹重磅炸弹”基因药物基因药物 第十三页，共十八页促红细胞生成素ª安进（安进（Amgen）开发的用于治疗恶性贫血症的第二代促红）开发的用于治疗恶性贫血症的第二代促红细胞生成素新产品细胞生成素新产品Arnesp2001年得到年得到FDA的批准，的批准，Arnesp2002年初正式年初正式(zhèngshì)上市。

上市ªArnesp：是一种：是一种“高糖基化高糖基化”促红素产品其促进红细胞促红素产品其促进红细胞生成的能力大大优于第一代生成的能力大大优于第一代EPO（促红细胞生成素）产品促红细胞生成素）产品第一年上市即大获全胜，赢得开们红，第一年上市即大获全胜，赢得开们红，Arnesp2002年全年全年销售额为年销售额为4.2亿美元，亿美元，2003年全年销售额为年全年销售额为15.4亿美元ª估计在今后估计在今后3年内，年内，Arnesp将创造将创造10亿亿~15亿美元的市场亿美元的市场销售额并夺取现有销售额并夺取现有EPO生产商的部分市场，其市场前景不生产商的部分市场，其市场前景不可估量第十四页，共十八页促红细胞生成素ª2001年，年，EPO（包括（包括(bāokuò)Arnesp）的全球销售额达）的全球销售额达21.1亿亿美元，美元，2002年达年达26.8亿美元，亿美元，2003年全世界年全世界EPO的年销售的年销售额超过额超过50亿美元创下生物工程药品单个品种之最，是当今亿美元创下生物工程药品单个品种之最，是当今最成功的基因工程药物最成功的基因工程药物 ª强生（强生（Johnson&Johnson）公司的促红细胞生成素）公司的促红细胞生成素Procrit/Eprex更是表现不俗，更是表现不俗，2001年销售额年销售额34.42亿美亿美元，元，2002年销售额年销售额42.69亿美元，亿美元， 2003年销售收入达到年销售收入达到39.84亿美元。

亿美元 第十五页，共十八页促红细胞生成素ª目前，国内已有目前，国内已有10多家单位获准生产红细胞多家单位获准生产红细胞生成素沈阳三生和上海麒麟鲲鹏（中国）生成素沈阳三生和上海麒麟鲲鹏（中国）生物药业的产品在国内医院的销售额独领风生物药业的产品在国内医院的销售额独领风骚，骚，2001年年EPO的国内医院销售总额约为的国内医院销售总额约为47449万元，万元，2002年为年为49508万元，万元，2003年上年上半年为半年为28606万元ª估计国内的年市场容量在估计国内的年市场容量在20到到30亿元左右，亿元左右，但目前年销售额只有区区但目前年销售额只有区区(qūqū)5亿元左右亿元左右ª综上所述，综上所述，EPO的市场前景非常可观的市场前景非常可观 EPO的市场前景的市场前景第十六页，共十八页促红细胞生成素第十七页，共十八页促红细胞生成素内容(nèiróng)总结基因工程药物——促红细胞生成素（EPO）基因工程药物——促红细胞生成素（EPO）3、近年来则利用三步层析法三步纯化基本流程(liúchéng)EPO的工艺流程(liúchéng)——①三步层析法EPO的工艺流程(liúchéng)——②三步纯化基本流程(liúchéng)。

THANK YOU第十八页，共十八页促红细胞生成素。