丹参酮ⅡA磺酸钠对AngⅡ诱导心房成纤维细胞胶原合成和TGF―β1活化影响.doc

丹参酮IIA磺酸钠对AngII诱导心房成纤维细胞胶原合成和TGF- B 1活化影响［摘要］目的：观察丹参酮IIA磺酸钠(sodium tanshinone IIA sulfonate , STS )对血管紧张素 II (angiotensin II, AngII)诱导心房成纤维细胞胶原合成 及TGF-B 1活化的影响方法：培养新生大鼠心房成纤维细 胞，检测胶原含量，并［3H］-脯氨酸掺入法测定胶原合成速 率作为心肌纤维化指标ELISA法检测培养细胞上清中活性 TGF-B 1及总TGF-B 1含量Western blot测定血小板反应 素T (thrombospondin-1, TSP-1)表达结果：AngII 能够 明显上调心房成纤维细胞胶原含量、胶原合成速率；TSP-1 表达及活性TGF-B 1分泌量上调，而总TGF-B 1表达无明显 改变在STS处理后，除总TGF-3 1外，其他指标均明显下 调结论：STS能减轻AngII诱导心房成纤维细胞胶原分泌 及合成速率，机制与抑制TSP-1/TGF-3 1通路有关［关键词］丹参酮IIA磺酸钠；心房纤维化；转化生长因 子- B 1心房颤动(房颤)为临床最常见的快速性心律失常，严 重危害人类健康，可致心功能不全及脑栓塞等并发症，明显 增加患者死亡率［1］。

新近研究提示在多种因素所致房颤模 型，均可见显著的心房纤维化(atrial fibrosis),后者干扰局部激动传导，造成单向传导阻滞，增加冲动不均一性和 碎裂电活动，促进房颤维持因此，心房纤维化是房颤维持 的关键因素，严重损害心功能［2］寻找治疗心房纤维化的治疗方法是改善房颤患者愈后的新途径研究表明血管紧张素II (angiotensin II, Ang II )是 心房纤维化发病机制中重要的一环，可通过血小板反应素-1(thrombospondin 1, TSPT) /转化生长因子1 (TGF-0 1) 途径诱导心肌重构［3-4］ o我国传统中药丹参临床上主要用 于冠心病的治疗［5］,本室也发现其能抑制心肌重构［6］,但 其对心房纤维化研究尚少本实验利用培养的新生大鼠心房 成纤维细胞，研究丹参的主要成分丹参酮IIA衍生物“丹参 酮 IIA 磺酸钠”(sodium tanshinone IIA sulfonate, STS)对AngII诱导的胶原分泌及合成速率，TSP-1/TGF-0 1通路 的影响，探讨STS抗MF的可能机制，为其在临床用于防 治心房纤维化提供实验依据1材料1. 1动物1〜2d龄新生Wistar大鼠，由同济医学院实验动物中心提供，动物许可证号SCXK (鄂)2004-0007o1. 2试剂与仪器AngII (Sigma公司)；STS (中国食品 药品检定研究院，批号S02001300)； DMEM干粉培养基、胰 蛋白酶、胎牛血清、［3H］-脯氨酸(中国科学院上海原子能 研究所）;PMSF 和 leupeptinCSigma 公司）；PVDF 膜（Amersham 公司)；務脯氨酸试剂盒及TGF- 3 1 ELISA试剂盒(南京建 成生物工程有限公司)；小鼠抗大鼠TSP-1 (Santa Cruz公 司)；其余试剂为国产分析纯。

LS3810液体闪烁仪(Beckman 公司)，垂直电泳仪及转膜系统(Biorad公司)2方法2. 1新生大鼠心房成纤维细胞(atrial fibroblasts, AFs)培养 取1〜2d龄的Wistar大鼠，在无菌条件下开胸 剪取心室肌，无菌条件下剪碎心肌，0.1%胶原酶消化液消化 后，加入含10胎牛血清的IMDM培养液制成细胞悬液，调整 细胞密度为1X105个/mL,根据心肌细胞和成纤维细胞贴壁 时间的不同，采用差速贴壁1 h,去除心肌细胞获得成纤维 细胞继续培养细胞至近融合状态时按1 :2传代传代后 成纤维细胞用抗波形蛋白(Vimentin)单克隆抗体免疫细胞 化学染色鉴定，纯度达到95%实验用第3〜5代的细胞2.2分组共分为5组，分别为①对照组，给予生理盐 水；AngII (0. 1 u mol • L-l)组；③Ang II (0. 1 u mol • LT) +STS (3 Li mol • LT)组；④ Ang II (0. 1 u mol •I -1) +STS (10 nmol • L-l)组；⑤AngII (0. 1 nmol • L-l) +STS (30 nmol • L-l)组。

2.3轻脯氨酸法测定胶原蛋白含量 各干预因素处理细 胞48 h后，取细胞上清液0. 5 mL,加无水乙醇1.2 mL,旋 涡混匀器充分混匀2 min, 2次，3 500 r • min-1离心10 min, 取上清（约1.5 mL）,烘干，加0. 5 mL双蒸水复溶，制成稀 释倍数为1的检测液，加试剂1, 2, 3 （具体见试剂盒说明 书），混匀，65 C水浴15 min,冷却后，在550 nm波长比 色胶原蛋白含量=7.46X轻脯氨酸含量（務脯氨酸含量占 胶原的13. 4%）o释脯氨酸二（A测定管-A空白管）/ （A标准 管-A空白管）X标准管浓度X稀释倍数2. 4胶原合成（[3H]-proline掺入率）的测定AFs接 种到24孔培养板，贴壁生长至汇合状态后，更换无血清培 养液，继续培养48 h,使AFs处于G0/G1期更换新的培养 液（含0. 4%FCS-DMEM及0. 3 mmol • L-1抗坏血酸），加入上 述各组干预，同时每孔加入37X106 Bq • L-1的 [3H]-proline,共育30 h后,0.25%的胰酶消化并收集细胞 在0.22 um的醋酸纤维素微孔滤膜上负压抽滤，生理盐水 和10%的三氯乙酸冲洗滤膜，95%乙醇脱色，烘干后置入闪烁 瓶中，加入二甲苯闪烁液4mL,静置过夜后，在液体闪烁仪 计数器（Tri-carb2300,美国Packard公司）上进行放射性 强度的测定。

2.5 ELISA法测定活性TGF-B1及总TGF-B 1含量 按TGF-B 1免疫检测试剂盒说明书分别检测细 胞培养上清中活性TGF- B 1及总TGF- B 1含量总TGF- B 1 检测样本需经1 mol • L-1盐酸化处理；活性TGF-B 1检测 采用非盐酸化处理的上清液各组所得结果与对照组进行对 比，进行统计分析2.6总蛋白的提取 取5X105个各组干预后的心房成纤 维细胞，加入5倍体积的裂解液孵育20 min,其组成为： Tris-HCl 50 mmol • L-l pH 8. 0, NaCl 150 mmol • L-l, EDTA 0. 5 mmol • LT, DTT 1 mmol • LT, NP-40 1%,脱氧胆酸 钠 0. 5%, SDS 0. 1%,飢酸钠 100 nmol • L-l, PMSF 100 mg• LT, apmtinin 1 mg • LT, leupeptin 2 mg • L-l, 冰浴 条件下进行组织匀浆，4 C, 12 000 r - min-1离心10 min, 取上清，用Folin酚法进行蛋白定量后保存于-70 CO2.7免疫印迹法检测TSP-1蛋白表达 取40 ug总蛋白 加入上样缓冲液煮沸3 min变性，经SDS-PAGE电泳分离蛋 白，然后电转移至PVDF膜上，封闭后与1 ： 1 000稀释的TSP-1 一抗4 C孵育过夜，与1 ： 1万稀释的二抗室温孵育1 h, 再与化学发光试剂ECL温浴1 min后曝光、显影和定影，对 结果进行吸光度扫描。

用目标蛋白表达量的灰度值除以内参 表达量的灰度值，以所得的比值表示目标蛋白的相对表达 量2.8统计学处理所有数据均采用KAKx-DU s表示， 用SPSS 12.0统计软件包进行单因素方差分析，以P 血 小板反应素T (TSP-1)也称凝血酶敏感素T,是一个相对 分子质量为450 kD的同源三聚体基质糖蛋白，最初发现于 血小板a颗粒内，随后被证明可由成纤维细胞、内皮细胞、 血管平滑肌细胞和单核细胞等多种细胞分泌[9-10] o研究表 明，在Angll活化成纤维细胞TGF-01的机制中，TSP-1起 到了非常重要的作用[3]本研究显示，Angll明显上调心房 成纤维细胞TSP-1表达，而STS处理后，TSP-1表达被显著 抑制综上所述，STS能减轻Angll诱导心房成纤维细胞胶原 分泌及合成速率，机制与抑制TSP-1/TGF-3 1通路有关下 一步研究要着重于STS对AngII-TGF- 3 1其他下游分子的影 响|如Smads, TGF-B激活的蛋白激酶T (TKA-1)等[5], 进一步阐明STS抗心肌纤维化的机制，为其在临床用于心房 纤维化的防治提供实验依据[参考文献][1] Garg A, Akoum N ・ At rial fibrilla tio n and hear t failure： beyond the hear t rate [J ]・ Curr Opin Cardiol, 2013, 28 (3)： 332.[2] Pellman J, Lyon R C, Sheikh F. Extracellular matrix remodeling in atrial fibrosis： mechanisms and implications in atrial fibrillation[J]・ J Mol Cell Cardiol, 2010, 48 (3)： 461.[3] Zhou Y, Poczatek M H, Berecek K H, et al. Thrombospondin 1 mediates angiotensin II induetion of TGF-beta activation by cardiac and renal cells imder both high and low glucose conditions[J]. BiochemBiophys Res Commun, 2006, 339 (2)： 633.[4] Tang M, Zhou F, Zhang W, et al. The role ofthrombospondin-1-mediated TGF-B 1 on collagen type III synthesis induced by high glucose[J]. Mol Cell Biochem, 2011, 346 (1/2)： 49.[5] Zhao B L, Jiang W, Zhao Y, et al. Scavengingeffects of Salvia miltiorrhiza on free radicals and its protection for myocardial mitochondrial membranes from ischemia reperfusion injury[J]. Biochem Mol Biol Int, 1996, 38 (6)： 1171.[6] 杨乐，邹晓静，冯俊，等.丹参酮IIA磺酸钠对血管紧张素II诱导的心肌肥大及p-ERK表达的影响[J].中国 医院药学杂志，2006, 26 (10)： 1191.[7] 武多娇•心肌纤维化药物治疗的研究进展[J].中国临床药理学与治疗学，2004, 9 (12)： 1327.[8] Ma Y X, Li W H, Xie Q・ Rosuvastatin inhibitsTGF-betalexpression and alleviates myocardialfibrosisin diabeticrats[J]・ Pharmazie,2013,68(5)。