钙成像实验操作及数据处理优秀课件.ppt

刘丝丝2017年8月25日钙成像实验操作及数据处理钙成像实验操作及数据处理1钙成像实验操作21.钙成像原理钙成像原理基本原理：基本原理：利用钙离子指示剂监测组织或细胞内钙离子浓度，进而反映组织或细胞内某些活动或反应钙离子指示剂：钙离子指示剂：能够指示钙离子的可视化物质32.￿实验操作实验操作￿操作步骤：操作步骤：（1）Fluo-4工作液配制：每管Fluo-4 AM：+8μlDMSO +2μlF-127（2）Fluo-4工作液使用：储液稀释1000倍使用（倍稀释数可根据实验调节）：1mlDMEM+1μlFluo-4工作液主要试剂及仪器：主要试剂及仪器：Fluo-4指示剂，DMSO，F-127，DMEM，HBSS，荧光显微镜或激光共聚焦显微镜42.￿实验操作实验操作￿（3）Fluo-4指示剂孵育：将培养皿中原培养基弃去，加入500-1000μlFluo-4溶液，37℃孵育20min4）清洗：将Fluo-4溶液弃去，用不含有钙、镁离子的HBSS溶液清洗3遍，每次2-3min，最后加上相应的浴液开始拍摄5）钙离子成像：使用普通荧光显微镜或者激光共聚焦显微镜进行拍摄以Leica SP5的CLSM为例：激发光：488nm采用xyt时间轴拍摄模式：Time interval：3s；Frames：200（根据实验而定）。

5钙成像数据处理6Ø必备软件必备软件 Image J MATLABOriginPhotoshopAdobe Illustrator71.图片处理，采集数据softstiffstiffstiffsoftsoft1.1.新建⽂件夹X，将待分析的组图⽂件（200张）考⼊⽂件夹X中1.2.导⼊图⽚：打开Image J 后， File ---- Import ---- Image sequence（会弹出新框Sequence Options , 点OK）1.3.变换颜色： Image ---- Lookup Tables ---- 16_colors（注意：如果是彩色的先转成灰度图）1.4.调对⽐度： Image ---- Adjust ---- Brightness /Contrast（会弹出新框B&C,将图⽚调节到最佳） ----Apply（会弹出新框Apply LUT to all 200[image numbers] slices in the stack? Choose YES） 81.图片处理，采集数据softstiffstiffstiffsoftsoft1.5.选细胞： Analyze ---- Tools ---- ROI Manager（会弹出新框ROI Manager） ---- 把Show all and Labels 前⾯打钩 ---- 主菜单栏⾥选择选择不同形状⼯具圈细胞（PS.先选择背景，再选择细胞） ---- 每圈⼀个细胞后点Add ---- 圈完所有细胞后截屏保存图⽚（PS.保存了标记细胞个数和顺序）⾄新建⽂件夹X中 1.6.数据导出： ROI Manager ---- More ---- Multi Measure （会弹出新框Multi Measure）---- 将Measure All 200[image numbers] Slices打钩 ---- OK ---- Results（会弹出新框Results） ----File ---- Save as（将Results数据保存为Excel格式命名Results.xls⾄新建⽂件夹X中） 91.图片处理，采集数据softstiffstiffsoftsoft1.7.在⽂件夹X中，新建⼀个Excel⽂件，将数据粘贴⾄新的Excel中命名为Results1.xls，只保留编号、 Mean、 Slice三列，将Area列删除1.8.Close the program Image J 在Analyze里面的Set Measurements可以设置Mean值102.Matlab数据处理softstiffstiffsoftsoft2.0. start the program Matlab2.1.复制程序：将程序⽂件CalciumFlow20101105.m拷⼊新建⽂件夹X中，此时⽂件夹X中应包括：原始图⽚⽂件夹、截屏图⽚、 Results.xls、 Results1.xls、 CalciumFlow20101105.m2.2.导⼊⽂件夹X：打开Matlab后，点右上⾓按钮…， 会弹出新框浏览⽂件夹，选中需导⼊的⽂件夹X后点确定，此时Matlab程序左侧会出现Current Folder，列出了⽂件夹X中所有⽂件2.3.双击打开⽂件夹X中新建的Excel⽂件Results1.xls（切勿打开原Excel⽂件），程序上⽅会弹出Results1.xls中的数据，点按钮Import ---- Import Data112.Matlab数据处理softstiffstiffsoftsoft2.4.修改程序：双击左侧打开⽂件夹X中CalciumFlow20101105.m，弹出程序语⾔，根据每次图⽚具体情况修改程序，包括修改三条路径（foutin=fopen、 fin=fopen、 fout=fopen），所圈细胞个数（nreg=），总图⽚数（np=），基线base line（nnp=20，15,10,5）的图⽚数，以及拍摄时间间隔（tstep=）2.5.运⾏程序：点击运⾏按钮 ----如若运⾏成功，左侧⽂件夹X中会出现in.txt和out.txt⽂件，则表明运⾏成功，否侧会出现运⾏错误提醒2.6.Close the program Matlab 123.Origin数据作图softstiffstiffsoftsoft3.0start the program Origins3.1.打开OriginPro 8.5后， File ---- Import ---- Single ASCII ----弹出新框导⼊⽂件夹X中out.txt⽂件，弹出Book3.2.点击Book的左上⾓全选后，右击， Plot ---- Line ——Line，弹出Graph1，保存3.3.Close the program Origins 134.文章作图softstiffstiffsoftsoft14Thanks for your attention!15。