植物基因工程中的λ噬菌体载体.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2021/2/8,#,植物基因工程中的,噬菌体载体,2013年6月29日,载体（vector）是把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术，送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具植物基因工程技术中尤为重要的,是载体，不同目的基因需要采用不同的载体组成植物,基因工程载体系统常见的几种载体有：质粒噬菌体柯斯质粒(cosmid)m13单链噬菌体噬菌体是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的细菌病毒，结构简单、基因数少，是分子生物学与基因工程的良好实验系统噬菌体有严格的宿主特异性，只寄居在易感宿主菌体内噬菌体具有高效率的感染性和自主复制繁殖性能，使它能高效导入受体细胞，并能使携带的外源基因在受体细胞中高效扩增，所以噬菌体被开发成基因工程的有用载体噬菌体(bacteriophage，phage)简介,噬菌体分类,毒性噬菌体（virulent phage）,：吸附、穿入、生物合成、成熟、,释放,温和噬菌体（temperate phage）,：转导、溶,源,性转换,噬菌体,温和噬菌体可有三种存在状态：溶菌周期的具有感染性的游离噬菌体颗粒；溶源周期的前噬菌体；宿主菌细胞质内的游离噬菌体核酸。

DNA重组技术一般需要,噬菌体进入溶菌状态目前用于基因克隆的噬菌体载体及其衍生载体有：单链M13噬菌体载体；噬菌体载体；P1噬菌体载体；噬菌粒载体；等等其中使用最多的是入噬菌体噬菌体,噬菌体是温和噬菌体，属长尾噬菌体科，头壳为直径约50nm的二十面体，其内包裹一长线状双链DNA分子（46500bp）左臂：从A到J长约20kb，其中的基因编码构成头部、尾部、尾丝对组装完整噬菌体所需要的蛋白质中段：从J到N长约20kb，是DNA整合和切出，溶原生长所需的序列,，,但非溶菌生长所必需,右臂：长约10kb，控制溶菌和溶原生长最重要的调控基因和序列、以及DNA复制起始均在这区域内基因组长约50kb，,至少包括61个基因，除少数例外，大多数编码基因均是按功能的相似性成簇排列左右臂包含DNA复制、噬菌体结构蛋白合成、组装成熟噬菌体、溶菌生长所需全部序列；对溶菌生长来说，中段是非必需的在DNA双链分子的两个5 端各有12,个核苷酸单链的互补粘性末端，,且两者的核苷酸序列互补，当噬菌体,感染宿主细胞后,，其DNA可迅速通过粘性末端配对而成双链环状DNA分子，这种由粘性末端结合形成的双链区域称为cos位点。

cos位点,（cohesive end site）,如果将左右臂和中段都去除，仅留下DNA而端包装噬菌体所必需的cos序列，再加上质粒的复制序列、标志基因、多克隆位点等，就可构成cos质粒或称为粘粒的载体粘粒可插入45kb长的外源DNA，然后用噬菌体外壳蛋白包装成噬菌体，感染大肠杆菌后，粘粒的DNA能以质粒的形式在细菌中繁殖而被克隆所以粘粒主要用于DNA文库的构建当,噬,噬,菌,菌,体,体,感,感,染,染,宿,宿,主,主,细,细,胞,胞,后,后,双,双,链,链DNA,分,分,子,子,通,通,过,过cos,而,而,成,成,环,环,状,状,在,在,感,感,染,染,早,早,期,期,环,环,状,状DNA,分,分,子,子,进,进,行,行,转,转,录,录,在,在,此,此,期,期,间,间,噬,噬,菌,菌,体,体,有,有,两,两,条,条,复,复,制,制,途,途,径,径,可,可,供,供,选,选,择,择:,一,一,是,是,裂,裂,解,解,生,生,长,长,环,环,状,状DNA,分,分,子,子,在,在,宿,宿,主,主,细,细,胞,胞,里,里,复,复,制,制,若,若,干,干,次,次,合,合,成,成,了,了,大,大,量,量,的,的,噬,噬,菌,菌,体,体,基,基,因,因,产,产,物,物,形,形,成,成,子,子,代,代,噬,噬,菌,菌,体,体,颗,颗,粒,粒,成,成,熟,熟,后,后,使,使,细,细,菌,菌,裂,裂,解,解,释,释,放,放,出,出,许,许,多,多,新,新,的,的,有,有,感,感,染,染,能,能,力,力,的,的,病,病,毒,毒,颗,颗,粒,粒,。

另,另,一,一,是,是,溶,溶,源,源,性,性,生,生,长,长,噬,噬,菌,菌,体,体DNA,整,整,合,合,进,进,宿,宿,主,主,菌,菌,的,的,基,基,因,因,组,组,然,然,后,后,像,像,细,细,菌,菌,染,染,色,色,体,体,上,上,的,的,基,基,因,因,一,一,样,样,进,进,行,行,复,复,制,制,并,并,传,传,递,递,给,给,下,下,一,一,代,代,细,细,菌,菌,由于噬菌体,头,头部包装容,量,量的限制，,重,重组-DNA分子大,小,小只能在3952kb之间噬菌体的,繁,繁殖方式,在感染的细,胞,胞内,噬菌体有两,条,条复制途径:,1、裂解生,长,长,2、溶源性,生,生长,DNA重组,技,技术一般需,要,要噬菌体,进,进入溶菌状,态,态噬菌体载,体,体的构建,构建方式：,1、插入型,只具有一,个,个限制酶位,点,点，可便于,外,外源DNA,插,插入，这种,载,载体叫插入,型,型载体（insertion vectors）2、置换型,含有二个,限,限制酶切点,，,，在两个位,点,点之间的DNA区段可,以,以被外源DNA片段所,取,取代这种,载,载体叫置换,型,型载体（replacementvectors）。

至今已用噬,菌,菌体开发出,许,许多插入型,和,和置换型载,体,体插入,型,型载体:ZAP,ZAP,gt10,gt11等,置,置换型载体:GEM-11,GEM-12,EMBL3,EMBL4等,构建过程,野生型噬,菌,菌体DNA,必,必须经过改,造,造才能成为,理,理想的载体,，,，其构建过,程,程主要有：,删除基因,组,组中非必需,区,区，建立外,源,源DNA片,段,段的替换点,，,，增加承载,外,外源DNA,片,片段的容量,在非必,需,需区内插入,或,或替换选择,的,的标记基因,和,和目的基因,建立重,组,组DNA,分,分子的体外,包,包装系统，,使,使之有效地,感,感染受体细,胞,胞简而言,之,之，将目的,基,基因插入或,替,替换进入病,毒,毒基因组的,可,可替代区，,再,再利用病毒,的,的侵染性，,将,将目的基因,导,导入受体细,胞,胞，这就是,病,病毒作为“,分,分子运输车,”,”的基本机,理,理噬菌体载,体,体的应用,一、建立,cDNA文,库,库,噬菌体载体,系,系统是在eDNA文库,构,构建中最早,使,使用的载体,系,系统，其主,要,要优点是插,入,入片段的装,载,载容量大，,适,适合于全长,的,的eDNA,克,克隆，不仅,质,质量高、代,表,表性好，而,且,且重组噬菌,体,体颗粒的感,染,染活性在4,环境中极,其,其稳定，非,常,常适合于eDNA文库,的,的长期保存,。

cDNA与,载,载体重组，,或,或经体外包,装,装成噬菌体,颗,颗粒后转导宿主细胞，,或,或不经体外,包,包装直接转染宿主细胞，,但,但转导的效,率,率较高DNA作,为,为外源基因,的,的克隆载体,基因组,中,中间部分占30%的DNA(包,括,括重组和溶,源,源化基因),并,并不是噬菌,体,体裂解生长,所,所必需的，,裂,裂解生长所,需,需的基因都,在,在基因组的,左,左侧和右侧,，,，而典型的,克隆载体,在,在部分或全,部,部非必需基,因,因的两侧含,有,有限制酶位,点,点，这就赋,予,予了载体,克,克隆大片段,的,的能力，外,源,源基因插入,到,到限制酶位,点,点之间，在,体,体外包装成,噬,噬菌体，虽,然,然包装效率,仅,仅达10%,，,，但一经包,装,装，在大肠,杆,杆菌中形成,噬,噬菌斑的效,率,率可达100%目,前,前由衍生,的,的许多载体,被,被广泛地应,用,用于基因克,隆,隆中，尤其,是,是在构建基,因,因文库中的,应,应用产生了,非,非常好的效,果,果二、克隆外,源,源目的序列,为,为了使外,源,源基因能有,效,效转录，将,其,其插入DNA的PL,启,启动子或PR启动子的,有,有效转录区,内,内。

噬菌体载,体,体的克隆原,理,理和步骤,（1）通过,裂,裂解过程增,殖,殖载体,通过噬菌体,的,的增殖，从,中,中提取噬菌,体,体DNA,噬菌体载体,均,均含有与裂,解,解生长所必,须,须的基因片,断,断，不同的,载,载体采用不,同,同的大肠杆,菌,菌宿主菌来,增,增殖经,过,过裂解生长,获,获得噬菌体,颗,颗粒，再经,过,过分级分离,分,分化，可用,于,于提取噬菌,体,体DNA2）载,体,体与外源片,断,断的酶切,插入型载体,来,来说，载体,被,被酶切后，,很,很容易自身,连,连接，一般,对,对载体的进,行,行去磷酸化,置换型载体,，,，切割后形,成,成左臂、填,充,充片断、右,臂,臂，填充片,断,断的存在会,影,影响连接效,率,率，必须纯,化,化左臂和右,臂,臂3）外源,片,片断与载体,的,的连接,通过载体的,粘,粘性末端，,将,将载体连接,成,成多联体，,以,以利于将两,个,个cos位,点,点之间的片,断,断装入噬菌,体,体颗粒,（4）重组,噬,噬菌体的体,外,外包装，形,成,成有感染力,的,的噬菌体颗,粒,粒,利用特殊材,料,料，制备噬,菌,菌体包装蛋,白,白,连接产物与,包,包装蛋白混,合,合时，就可,完,完成包装反,应,应，形成有,感,感染力的噬,菌,菌体颗粒,包装蛋白对,所,所包装的DNA大小有,高,高度选择性,，,，范围：,DNA分,子,子的75,105,噬菌体的,改,改造,设计去除DNA上的,多,多余序列和,一,一些限制性,酶,酶切点：因,为,为DNA,较,较大，序列,中,中的限制性,酶,酶切点过多,，,，妨碍其应,用,用。

在中段非必,需,需区，替换,或,或插入某些,标,标志基因，,如,如上述的可,供,供蓝白筛选lacZ,序,序列和多克,隆,隆位点等建立重组DNA分子,的,的体外包装,系,系统与一般的质,粒,粒载体不同,噬菌体,转,转染前需要,利,利用噬菌体,外,外壳蛋白和,噬,噬菌体DNA加工酶组,成,成的混合物(包装抽提,物,物,)在体外将,连,连接好的DNA线性分,子,子包装成噬,菌,菌体颗粒,草菇噬菌体,基,基因文库的,构,构建(,见,见文献附件,）,）,。