基因治疗肿瘤的策略.ppt

基因治疗肿瘤的策略 肿肿瘤瘤基基因因治治疗疗已已成成为为肿肿瘤瘤生生物物治治疗疗最最引引人人瞩瞩目目的的研研究究领领域域，，是是继继手手术术、、放放疗疗、、化化疗疗、、免免疫疫治治疗疗之之后后的的第第五五种种模式模式,是肿瘤治疗的有益补充是肿瘤治疗的有益补充基基因因治治疗疗就就是是用用正正常常或或野野生生型型基基因因校校正或置换致病基因的一种治疗方法正或置换致病基因的一种治疗方法基因治疗肿瘤的策略基因治疗的基本程序：基因治疗的基本程序：1.目的基因准备；目的基因准备；2.受体细胞（靶细胞）培养；受体细胞（靶细胞）培养；3.载体的选择与克隆；载体的选择与克隆；4.将目的基因导入靶细胞；将目的基因导入靶细胞；5.转导细胞的选择和鉴定；转导细胞的选择和鉴定；6.基因治疗的安全性鉴别及疗效评价基因治疗的安全性鉴别及疗效评价 基因治疗肿瘤的策略基因治疗的主要措施有：基因治疗的主要措施有：1.基因置换基因置换（gene replacement）将致病基因整个的换以 正常基因，使致病基因永久的得到更正；2.基因修正基因修正（gene correction）将基因的突变碱基序列 纠正，而正常部分给予保留；3.基因修饰基因修饰（gene augmentation）将目的基因导入病变 细胞或其它细胞，目的基因的表达产物修饰改 变缺陷细胞的功能，或使原有的功能得到增强；4.基因失活基因失活（gene inactivation）应用反义核苷酸或核酶特异 的封闭某些致病基因的表达； 基因治疗肿瘤的策略区别几个概念：区别几个概念：将目的基因导入细胞或细菌，针对目的基因叫做转移将目的基因导入细胞或细菌，针对目的基因叫做转移（（transfer））针对宿主细胞叫做转导（针对宿主细胞叫做转导（transduction））而这一过程叫做转染（而这一过程叫做转染（transfection））目的基因导入细胞导致宿主细胞的基因组分级至性状的改变叫目的基因导入细胞导致宿主细胞的基因组分级至性状的改变叫做转化（做转化（transformation）） 基因治疗肿瘤的策略第一节第一节 增强宿主抗肿瘤免疫增强宿主抗肿瘤免疫——肿瘤疫苗的作用肿瘤疫苗的作用 抗肿瘤免疫有关的转基因治疗是肿瘤基因治疗的最初方抗肿瘤免疫有关的转基因治疗是肿瘤基因治疗的最初方案。

为增强机体免疫系统对肿瘤的识别，免疫基因治疗主要案为增强机体免疫系统对肿瘤的识别，免疫基因治疗主要包括包括一、通过一、通过APC增强对肿瘤抗原的识别与呈递增强对肿瘤抗原的识别与呈递二、增加肿瘤细胞表达细胞因子二、增加肿瘤细胞表达细胞因子三、增强肿瘤细胞表达的共刺激分子三、增强肿瘤细胞表达的共刺激分子基因治疗肿瘤的策略一、以树突细胞为基础的肿瘤抗原免疫一、以树突细胞为基础的肿瘤抗原免疫 通过通过APC（（Antigen Presenting Cells）增强对肿瘤）增强对肿瘤抗原的识别与呈递将编码目的抗原的基因，以重组抗原的识别与呈递将编码目的抗原的基因，以重组表达载体的形式经各种基因转移途径转入机体细胞，表达载体的形式经各种基因转移途径转入机体细胞，借用宿主细胞的表达加工机构合成抗原分子如通过借用宿主细胞的表达加工机构合成抗原分子如通过主要组织相容性复合体（主要组织相容性复合体（Major Histocompatibility Complex，， MHC））Ⅰ和和/或或MHCⅡ类分子抗原处理和输类分子抗原处理和输送途径将抗原信息呈递给送途径将抗原信息呈递给T淋巴细胞，从而激发体液免淋巴细胞，从而激发体液免疫和细胞免疫。

疫和细胞免疫基因治疗肿瘤的策略二、细胞因子的免疫基因治疗二、细胞因子的免疫基因治疗 将将IL-1、、IL-4、、TNFα、、IFN等细胞因子基因导入肿等细胞因子基因导入肿瘤细胞，使瘤细胞表达出相应的抗原，随后激发瘤细胞，使瘤细胞表达出相应的抗原，随后激发CD4+毒性毒性T淋巴细胞淋巴细胞(Cytotoxic T Lymphocyte ，，CTL)反应，而导致反应，而导致分泌肿瘤抗原的靶细胞溶解，以达到治疗肿瘤的目的分泌肿瘤抗原的靶细胞溶解，以达到治疗肿瘤的目的 如如Shiau等在体内给予表达干扰素等在体内给予表达干扰素-γ的逆转录病毒进行的逆转录病毒进行鼠膀胱癌切除后的免疫基因治疗鼠膀胱癌切除后的免疫基因治疗,其目的是增加肿瘤细胞在其目的是增加肿瘤细胞在局部产生干扰素局部产生干扰素-γ,以诱导淋巴细胞的反应达到治疗目的以诱导淋巴细胞的反应达到治疗目的这种能产生细胞因子的转基因瘤细胞具有肿瘤疫苗的作用，这种能产生细胞因子的转基因瘤细胞具有肿瘤疫苗的作用，这种肿瘤疫苗有替代无效的辅助性Ｔ细胞（这种肿瘤疫苗有替代无效的辅助性Ｔ细胞（Helper T Lymphocyte ，，TH）的作用，并对机体内远处的肿瘤具有）的作用，并对机体内远处的肿瘤具有抑制作用。

抑制作用 基因治疗肿瘤的策略 将细胞因子基因导入肿瘤浸润的淋巴细胞（将细胞因子基因导入肿瘤浸润的淋巴细胞（Tumor Infiltrating Lymphocyte ，，TIL）和淋巴因子激活的杀伤性）和淋巴因子激活的杀伤性细胞（细胞（Lymphokine Activated Killer cell ，，LAK细胞），细胞），使之活化，活化的使之活化，活化的TIL具有显著抗自身肿瘤作用回输体具有显著抗自身肿瘤作用回输体内后趋向于肿瘤局部聚集，并大量表达其携带能增强抗肿内后趋向于肿瘤局部聚集，并大量表达其携带能增强抗肿瘤免疫的细胞因子基因产物瘤免疫的细胞因子基因产物 Hull等比较了伴有等比较了伴有IL-12和共刺激分子和共刺激分子B7-1（（AdmIL12/B7）两个载体表达的腺病毒和单纯伴有）两个载体表达的腺病毒和单纯伴有IL-12/B7（（AdmIL-12）表达的腺病毒感染具有较差免疫原性）表达的腺病毒感染具有较差免疫原性的的RM-9鼠前列腺癌模型，研究发现在感染的鼠前列腺癌模型，研究发现在感染的RM-9鼠肿瘤鼠肿瘤细胞中细胞中AdmIL-12/B7能介导能介导IL-12分泌和增加分泌和增加B7-1在细胞表在细胞表面的表达面的表达,通过在比较体内注射通过在比较体内注射AdmIL-12/B7、、AdmIL-12和和对照组的疗效比较显示前者能明显的减少肿瘤体积和增加对照组的疗效比较显示前者能明显的减少肿瘤体积和增加鼠的存活率。

使用两个载体的肿瘤治疗将滤过更多鼠的存活率使用两个载体的肿瘤治疗将滤过更多CD4+CD8+ 的免疫反应细胞的免疫反应细胞基因治疗肿瘤的策略三、共刺激分子的作用三、共刺激分子的作用 将将MHCⅠ、、Ⅱ类抗原基因导入肿瘤细胞，使宿主免类抗原基因导入肿瘤细胞，使宿主免疫系统识别肿瘤细胞为疫系统识别肿瘤细胞为“异己异己”，以诱发抗肿瘤免疫反，以诱发抗肿瘤免疫反应可见基因免疫综合了减毒疫苗和亚单位疫苗的精髓，应可见基因免疫综合了减毒疫苗和亚单位疫苗的精髓，既象接种了活的病原体可以不断地表达抗原蛋白，又可既象接种了活的病原体可以不断地表达抗原蛋白，又可以方便地精选所需基因片段，以激发理想的免疫反应以方便地精选所需基因片段，以激发理想的免疫反应Matubonis等研究的结果表明，某些肿瘤细胞等研究的结果表明，某些肿瘤细胞APC表面表面存在有共刺激分子存在有共刺激分子B7-16（（CD80）表达时，更难有效地）表达时，更难有效地激活激活CTL，基因疫苗激活的，基因疫苗激活的CTL具有高度的特异性和具有高度的特异性和MHC-I类分子限制性，其目的在于排除细胞外蛋白与核类分子限制性，其目的在于排除细胞外蛋白与核酸的侵袭，这对防止杀伤作用的扩散及维持机体核酸物酸的侵袭，这对防止杀伤作用的扩散及维持机体核酸物质的稳定具有重要意义质的稳定具有重要意义。

基因治疗肿瘤的策略 应用这一手段前提是必须有肿瘤抗原的存在，应用这一手段前提是必须有肿瘤抗原的存在，特别是肿瘤特异性抗原，只有这样才可使诱导特别是肿瘤特异性抗原，只有这样才可使诱导的免疫反应只针对肿瘤而不破坏正常组织以的免疫反应只针对肿瘤而不破坏正常组织以往寻求肿瘤特异性抗原，先从寻找癌基因开始，往寻求肿瘤特异性抗原，先从寻找癌基因开始，然后再从基因推导肽片断，近年来发展了一个然后再从基因推导肽片断，近年来发展了一个原来方法相反的研究路线，即先分离可识别肿原来方法相反的研究路线，即先分离可识别肿瘤特异性肽的瘤特异性肽的CTL，再通过，再通过CTL寻找其编码肽寻找其编码肽的基因通过这种方法，发现了黑色素瘤基因的基因通过这种方法，发现了黑色素瘤基因MAGE-1，其编码的抗原可为人类黑色素瘤的特，其编码的抗原可为人类黑色素瘤的特异性异性T细胞所识别细胞所识别 基因治疗肿瘤的策略 Hu Xueyou等等合合成成了了MAGE·AL九九肽肽，，负负载载自自体体APC后后给给病病人人免免疫疫，，发发现现可可引引起起原原位位和和远远距距离离部部位位的的自自体体黑黑色色素素瘤瘤反反应应和和特特异异性性CTL数数量量增增加加，，说说明明此此法法可可诱诱导导肽肽特特异异性性CTL应应答答并并进进行行循循环环。

这这一一研研究究结结果果为为特特异异性性抗抗黑黑色色素素瘤瘤的的免免疫疫治治疗疗显显示示了了良良好好的的应应用用前前景 免免疫疫基基因因治治疗疗有有助助于于克克服服抗抗癌癌治治疗疗中中碰碰到到的的肿肿瘤瘤异质性、化疗耐受性、肿瘤细胞低免疫原性等困难异质性、化疗耐受性、肿瘤细胞低免疫原性等困难基因治疗肿瘤的策略 第二节第二节 恢复和增强抑癌基因的功能恢复和增强抑癌基因的功能——引入抑癌基因引入抑癌基因 抑癌基因是抗肿瘤基因治疗中一类极为重要抑癌基因是抗肿瘤基因治疗中一类极为重要的目的基因，将这类基因导入肿瘤细胞或非肿瘤的目的基因，将这类基因导入肿瘤细胞或非肿瘤细胞，其表达产物通过复杂的基因调节或活化代细胞，其表达产物通过复杂的基因调节或活化代谢机制，能抑制肿瘤的恶性生长，甚至可导致癌谢机制，能抑制肿瘤的恶性生长，甚至可导致癌细胞逆转虽然肿瘤的发生发展是一个多基因参细胞逆转虽然肿瘤的发生发展是一个多基因参与、多步骤形成的过程，但在这些过程中某种癌与、多步骤形成的过程，但在这些过程中某种癌基因的激活或抑癌基因的失活可能起到了关键性基因的激活或抑癌基因的失活可能起到了关键性的作用。

的作用基因治疗肿瘤的策略 用基因替代等方法恢复或增强抑癌基因杂合性的缺用基因替代等方法恢复或增强抑癌基因杂合性的缺失，将某些含有抑癌基因的染色体片断或整条染色体臂失，将某些含有抑癌基因的染色体片断或整条染色体臂导入那些已知或疑有抑癌基因缺失的肿瘤细胞或荷瘤动导入那些已知或疑有抑癌基因缺失的肿瘤细胞或荷瘤动物体内，以消除肿瘤细胞的恶性表型和在体内致癌性，物体内，以消除肿瘤细胞的恶性表型和在体内致癌性，从而达到控制肿瘤细胞异常生长的目的从而达到控制肿瘤细胞异常生长的目的 基因治疗和免疫的靶特异性分子治疗已进入临床研基因治疗和免疫的靶特异性分子治疗已进入临床研究阶段如通过载有野生型究阶段如通过载有野生型P53的腺病毒载体进行瘤体内的腺病毒载体进行瘤体内注射这种用病毒载体介导的转导肿瘤抑制基因治疗方注射这种用病毒载体介导的转导肿瘤抑制基因治疗方法代表了癌症治疗的策略之一用肿瘤抑制基因如法代表了癌症治疗的策略之一用肿瘤抑制基因如P53、、Rb治疗因那些有这类基因突变的肿瘤是有价值的治疗因那些有这类基因突变的肿瘤是有价值的 基因治疗肿瘤的策略 体外转导抑癌基因对恶性肿瘤特征的影响有：体外转导抑癌基因对恶性肿瘤特征的影响有： 转导转导WT、、p53能使结肠癌、骨肉瘤、神经胶质瘤、能使结肠癌、骨肉瘤、神经胶质瘤、腺癌增殖降低；腺癌增殖降低； 转导转导Rb基因能使视网膜母细胞瘤、骨肉瘤、前列腺基因能使视网膜母细胞瘤、骨肉瘤、前列腺癌增殖降低；癌增殖降低； 转导转导wT-1能使裸鼠体内能使裸鼠体内wilms’瘤形成下降；转导瘤形成下降；转导NF1能使神经纤维瘤病病灶减少；能使神经纤维瘤病病灶减少； 增加增加p16基因能使裸鼠体内神经胶质瘤形成减少。

基因能使裸鼠体内神经胶质瘤形成减少 基因治疗肿瘤的策略 在实体肿瘤中抑癌基因在实体肿瘤中抑癌基因P53分子对由化疗引分子对由化疗引起的起的DNA损伤有重要的作用损伤有重要的作用,可引起细胞周期停可引起细胞周期停滞与促使细胞凋亡，在食道癌研究中已获疗效滞与促使细胞凋亡，在食道癌研究中已获疗效自从自从1994年年Okamato等构建含有等构建含有p16INK4cDNA的表达载体的表达载体pCMV-p16，成功地转染，成功地转染p16INK4基基因缺失的肺癌细胞系因缺失的肺癌细胞系Calu-6和卵巢癌细胞系和卵巢癌细胞系SKOV-3，抑制了瘤细胞株的集落形成率，并使，抑制了瘤细胞株的集落形成率，并使瘤细胞的继续生长得到控制此后，在头颈部瘤细胞的继续生长得到控制此后，在头颈部癌、卵巢癌中用腺病毒介导野生型癌、卵巢癌中用腺病毒介导野生型P53去消除去消除P53的突变，取得一定的疗效的突变，取得一定的疗效 基因治疗肿瘤的策略 Nakamura等用野生型等用野生型P53肿瘤抑制基因替代肿瘤抑制基因替代疗法对结肠癌的治疗已在临床前期研究中获得成疗法对结肠癌的治疗已在临床前期研究中获得成功，还有待于临床阶段的进一步工作证明。

功，还有待于临床阶段的进一步工作证明Schrump等对食管鳞状细胞癌系，等对食管鳞状细胞癌系， Fueyo、、Higashi等分别对不同的神经胶质瘤细胞系进行等分别对不同的神经胶质瘤细胞系进行p16INK4基因替代治疗研究，证明基因替代治疗研究，证明p16INK4基因基因的替代治疗可以抑制肿瘤细胞的生长进一步的的替代治疗可以抑制肿瘤细胞的生长进一步的研究发现，这种抑制作用是有选择的，对研究发现，这种抑制作用是有选择的，对Rb基因基因缺失以及缺失以及p16INK4基因正常的肿瘤细胞无明显抑基因正常的肿瘤细胞无明显抑制作用基因治疗肿瘤的策略 在研究中人们还发现在研究中人们还发现p16INK4基因正常的癌基因正常的癌细胞株往往都有细胞株往往都有p53基因异常，基因异常，p53基因正常的癌基因正常的癌细胞株常有细胞株常有p16INK4基因变异，同时伴随基因变异，同时伴随cyclin D1的过度表达因此，的过度表达因此，p16INK4基因与其它基因基因与其它基因联合治疗将能更好地抑制肿瘤联合治疗将能更好地抑制肿瘤 Sandig等等用用p53-p16重重组组病病毒毒注注射射到到患患肝肝癌癌的的小小鼠鼠中中，，肿肿瘤瘤生生长长出出现现逆逆转转，，提提示示了了引引入入抑抑癌癌基因在肿瘤治疗中的前景。

基因在肿瘤治疗中的前景基因治疗肿瘤的策略第三节第三节 阻断癌基因功能阻断癌基因功能--反义核酸反义核酸RNA干扰技术干扰技术 细胞中原癌基因的表达受到严格控制细胞中原癌基因的表达受到严格控制ras、、myc、、src这一类癌基因由于突变而使其功能处于这一类癌基因由于突变而使其功能处于异常活跃状态，不断地激活细胞内正性调控细胞异常活跃状态，不断地激活细胞内正性调控细胞生长和增殖的信号传递通路，促使细胞异常生长生长和增殖的信号传递通路，促使细胞异常生长因此基因治疗思路也可以将癌基因反义序列导入因此基因治疗思路也可以将癌基因反义序列导入癌细胞来拮抗癌基因；或引入非等位癌细胞来拮抗癌基因；或引入非等位rev等方法，等方法，阻止癌基因功能阻止癌基因功能 基因治疗肿瘤的策略 反义核酸技术的基本原理是根据核酸碱基互反义核酸技术的基本原理是根据核酸碱基互补配对的规律设计出能与靶基因特定区域结合补配对的规律设计出能与靶基因特定区域结合的的DNA或或RNA，以影响其靶基因的表达，抑制，以影响其靶基因的表达，抑制其功能 RNA干扰干扰(RNA interference,RNAi)是由双链是由双链RNA分子介导的序列特异性转录后基因沉默过分子介导的序列特异性转录后基因沉默过程，为双链程，为双链RNA分子在分子在mRNA水平上关闭相关水平上关闭相关基因表达的过程基因表达的过程,是一项新兴的基因阻断技术。

是一项新兴的基因阻断技术RNAi是一种转录后基因沉默是一种转录后基因沉默(post transcriptional gene silencing,PTGS)现象 基因治疗肿瘤的策略 有关基因沉默现象最早的报道见于植物中有关基因沉默现象最早的报道见于植物中1995年年Gou等在对线虫的实验中发现等在对线虫的实验中发现,正义正义RNA与反与反义义RNA一样可以阻断一样可以阻断par-1基因的表达基因的表达,但作者对这一但作者对这一现象没有进行更深入的研究现象没有进行更深入的研究1998年年, Fire等首次将正义链和反义链的等首次将正义链和反义链的RNA结合物结合物———双链双链RNA(double stranded RNA, dsRNA)注入注入线虫线虫,结果诱发了比单独注射正义链或者反义链都要结果诱发了比单独注射正义链或者反义链都要强得多的基因沉默强得多的基因沉默,每个细胞只要很少几个分子的双每个细胞只要很少几个分子的双链链RNA就足以完全阻断同源基因的表达后续的实就足以完全阻断同源基因的表达后续的实验还证实验还证实,虫体内注入双链虫体内注入双链RNA,不但可以阻断整不但可以阻断整个线虫的所有同源基因的表达个线虫的所有同源基因的表达,还会导致其第还会导致其第1代子代代子代的同源基因沉默的同源基因沉默,他们将这种现象命名为他们将这种现象命名为RNAi。

此后，此后，在多种生物体内陆续发现了在多种生物体内陆续发现了RNAi现象现象, 基因治疗肿瘤的策略 许许多多学学者者认认为为,在在生生物物中中广广泛泛存存在在的的PTGS现现象象可可视视作作不不同物种所共有的适应保护机制同物种所共有的适应保护机制:通通过过阻阻抑抑大大量量的的异异常常mRNA表表达达,抵抵抗抗转转座座子子和和病病毒毒的的侵侵袭袭,以保护机体免于受损以保护机体免于受损,相当于基因组的免疫系统；相当于基因组的免疫系统；通过调节编码蛋白基因的表达起到调控生命活动的作用通过调节编码蛋白基因的表达起到调控生命活动的作用RNAi在在哺哺乳乳动动物物中中的的研研究究主主要要集集中中在在干干扰扰病病毒毒在在体体内内的的复复制、抑制癌基因表达及基因敲除后基因功能的研究等方面制、抑制癌基因表达及基因敲除后基因功能的研究等方面基因治疗肿瘤的策略与与传传统统的的基基因因研研究究方方法法—基基因因敲敲除除、、定定点点突突变变、、反反义义核核酸酸及及核核酶酶技技术术等等相相比比 ，，RNAi具具有有以以下下五大特点：五大特点：基因序列特异性；基因序列特异性；dsRNA的稳定性；的稳定性；沉默信号传递性；沉默信号传递性；Knock-down高效性；高效性；RNAi效用浓度依赖性。

效用浓度依赖性基因治疗肿瘤的策略一、一、RNAi的分子机制的分子机制 外源性外源性(如病毒如病毒) 或内源性的或内源性的dsRNA 在细胞内与一种在细胞内与一种RNA 酶酶Ⅲ(RNAase Ⅲ核酸内切酶核酸内切酶) Dicer 结合结合,随即被切割成随即被切割成21～～23nt 的带有的带有3’端单链尾巴及磷酸化端单链尾巴及磷酸化5’端的短链端的短链dsRNA ,即小干扰即小干扰RNA（（small interfereing RNA,siRNA）siRNA 与与Dicer 形成形成RNA引导沉默的复合体引导沉默的复合体(RNA induces silencing comple ,RISC) siRNA 作为引导序列作为引导序列,按照碱基互补原则识按照碱基互补原则识别靶基因转录出的别靶基因转录出的mRNA , 并引导并引导RICS 结合结合mRNA随后siRNA与与mRNA 在复合体中换位在复合体中换位,核酸酶核酸酶Dicer 将将mRNA 切割切割成成21～～23nt 的片段的片段,特异性地抑制靶基因的表达而新产生特异性地抑制靶基因的表达而新产生的的dsRNA 片段可再次形成片段可再次形成RISC ,继续降解继续降解mRNA ,从而产生从而产生级联放大效应。

因此级联放大效应因此,每个细胞只需要几个每个细胞只需要几个siRNA 分子就能分子就能够引起强烈的够引起强烈的RNAi 效应此外效应此外, siRNA 还可以在还可以在RNA 依赖依赖性性RNA 聚合酶聚合酶(RNA dependentRNA polymerase ,RdRp) 的的作用下进行大量扩增作用下进行大量扩增,并转运出细胞并转运出细胞,使使RNAi 扩散到整个机体扩散到整个机体并可以传代并可以传代 基因治疗肿瘤的策略基因治疗肿瘤的策略阐阐明明siRNA在在双双链链RNA诱诱发发的的基基因因沉沉默默中中的的作作用用是是RNA干干扰研究中最重要的发现之一达到这一目的有几种途径：扰研究中最重要的发现之一达到这一目的有几种途径：⑴⑴ 利利用用质质粒粒载载体体或或病病毒毒载载体体转转化化或或转转染染瘤瘤细细胞胞，，在在细细胞胞内内转转录录出出能能与与目目的的基基因因正正义义RNA相相互互补补的的反反义义RNA，，从从而而阻阻断目的基因蛋白质的表达断目的基因蛋白质的表达⑵⑵ 体外人工合成反义寡聚核苷酸体外人工合成反义寡聚核苷酸由于脱氧核苷酸的合成较容易，在体液中也比较稳定，而由于脱氧核苷酸的合成较容易，在体液中也比较稳定，而脱氧核苷酸也同样可以与脱氧核苷酸也同样可以与RNA相互配对结合，所以在实践相互配对结合，所以在实践中多用反义核苷酸（中多用反义核苷酸（antisense oligodeoxyribonucleotide, AS-ODN）。

与蛋白质水平相比，从遗传水平抑制基因表达能更有效地与蛋白质水平相比，从遗传水平抑制基因表达能更有效地阻断疾病的发生发展阻断疾病的发生发展 基因治疗肿瘤的策略二、二、RNAi在肿瘤治疗中的意义在肿瘤治疗中的意义 ras 基因包括基因包括K-ras、、H-ras、、N-ras ,是鸟苷酸结合是鸟苷酸结合蛋白蛋白,对细胞的繁殖、分化和细胞生存起调控作用对细胞的繁殖、分化和细胞生存起调控作用ras 基因突变可使之处于长期激活基因突变可使之处于长期激活GTP 结合状态结合状态,易导致肿易导致肿瘤的发生瘤的发生K-ras基因在人类肿瘤中最普遍活化状态的致基因在人类肿瘤中最普遍活化状态的致癌基因，在肿瘤组织中的突变率癌基因，在肿瘤组织中的突变率30-50%，在胰腺癌中高，在胰腺癌中高达达85%突变的Ras基因与正常细胞中的野生型基因与正常细胞中的野生型ras基因基因通常只有一个碱基的不同，但由于通常只有一个碱基的不同，但由于RNAi的高度特异性，的高度特异性，可以针对肿瘤细胞中突变的可以针对肿瘤细胞中突变的ras基因产生抑制作用，而对基因产生抑制作用，而对正常细胞的野生型正常细胞的野生型ras不产生抑制作用。

不产生抑制作用 基因治疗肿瘤的策略最近最近Li-Mo Chen等报道建立等报道建立K-rasV12突变基因的突变基因的siRNA腺病毒表达载体腺病毒表达载体,转染转染Panc-1胰腺癌细胞诱导凋亡、逆转胰腺癌细胞诱导凋亡、逆转肿瘤恶性表型肿瘤恶性表型Wei Wang等通过构建等通过构建K-ras基因的基因的siRNA 表达框架表达框架(siRNA expression cassette,SEC)成功抑制胰腺癌细胞株成功抑制胰腺癌细胞株MiaPaCa-2的的K-ras表达Fleming等报道，利用化学合成等报道，利用化学合成anti-K-ras-siRNA抑制了抑制了PANC-1和和MaiPaca-2胰腺癌细胞胰腺癌细胞K-ras的表达，并观测到的表达，并观测到集落形成能力、细胞增殖能力和侵袭能力降低、凋亡增集落形成能力、细胞增殖能力和侵袭能力降低、凋亡增加，与加，与VEGF）和血小板反应素（）和血小板反应素（thrombspondin-1，，TSP-1）基因和）基因和c-myc的下游调控元件、与肿瘤转移相关的下游调控元件、与肿瘤转移相关的葡萄糖转运蛋白的葡萄糖转运蛋白1（（glucosue transporter，，GLUT-1）基）基因表达变化。

因表达变化 基因治疗肿瘤的策略癌胚抗原相关细胞黏附分子癌胚抗原相关细胞黏附分子6（（CEARAM6）是免疫球）是免疫球蛋白超家族的成员，在许多肿瘤中都有表达，对肿瘤的蛋白超家族的成员，在许多肿瘤中都有表达，对肿瘤的形成、抵抗形成、抵抗“失巢凋亡失巢凋亡”（（anoikis：正常内皮细胞或：正常内皮细胞或表皮细胞黏附不适宜的基质时引起细胞凋亡的一种现象）表皮细胞黏附不适宜的基质时引起细胞凋亡的一种现象）和形成转移起到重要作用和形成转移起到重要作用Duxbury MS等通过化学合成等通过化学合成anti-CEARAM6-siRNA 抑抑制失巢凋亡高抵抗性制失巢凋亡高抵抗性MiaPaCa-2胰腺癌细胞株的胰腺癌细胞株的CEARAM6的表达，观察到失巢凋亡抵抗性的减弱以及的表达，观察到失巢凋亡抵抗性的减弱以及肿瘤细胞在体内、外模型中转移能力的降低他们还分肿瘤细胞在体内、外模型中转移能力的降低他们还分别利用逆转录病毒别利用逆转录病毒siRNA表达载体和化学合成的方法介表达载体和化学合成的方法介导了对导了对CEARAM6基因高表达基因高表达BXPC3胰腺癌细胞株胰腺癌细胞株CEARAM6基因的敲减基因的敲减,观测到肿瘤细胞侵袭能力降低、观测到肿瘤细胞侵袭能力降低、转移瘤生成能力下降，进一步证明了转移瘤生成能力下降，进一步证明了CEARAM6基因在基因在肿瘤形成、转移过程中起重要作用，为肿瘤的肿瘤形成、转移过程中起重要作用，为肿瘤的RNAi治治疗提供了作用靶点。

疗提供了作用靶点 基因治疗肿瘤的策略BCR/ABL融合基因是定位于人融合基因是定位于人9q34上的上的C-ABL基因和基因和22q11上的上的BCR基因发生基因发生t(9:22)易位，使相应无关的基因易位，使相应无关的基因发生融合而形成，它是发生融合而形成，它是PH染色体的分子基础，在染色体的分子基础，在CML发发病中起到重要作用病中起到重要作用Borkhardt等采用等采用RNAi技术成功地抑制了技术成功地抑制了K562白血病细白血病细胞中的胞中的BCR/ABL融合基因融合基因mRNA的表达，增加对的表达，增加对K562白白血病细胞凋亡的诱导作用，但在联合血病细胞凋亡的诱导作用，但在联合ABL酪氨酸抑制剂酪氨酸抑制剂--Imatinib治疗时，对细胞凋亡没有相加作用治疗时，对细胞凋亡没有相加作用 基因治疗肿瘤的策略RNAi技术的快速发展必将推动生物学和医学的大步前技术的快速发展必将推动生物学和医学的大步前进RNAi在医学领域的应用也必将为各种疾病尤其是在医学领域的应用也必将为各种疾病尤其是肿瘤等疾病的根治带来希望但是肿瘤等疾病的根治带来希望但是,从目前从目前RNAi的研究的研究现状来看现状来看,在哺乳动物中在哺乳动物中,RNAi并不能完全阻断基因的表并不能完全阻断基因的表达达,尤其是异常高表达的基因尤其是异常高表达的基因,这将促使人们去探索研究这将促使人们去探索研究新的更高效新的更高效siRNA表达载体体系。

为了促进基于表达载体体系为了促进基于RNAi的基因药物进入临床研究和应用的基因药物进入临床研究和应用,大量的研究已集中到大量的研究已集中到提高提高siRNA分子的工业化生产能力、增加分子的工业化生产能力、增加siRNA分子稳分子稳定性、开发定性、开发siRNA药物的靶向传递系统等方面尽管如药物的靶向传递系统等方面尽管如此此,RNAi在癌症治疗中的应用已经取得非常大的成就在癌症治疗中的应用已经取得非常大的成就,因因此我们有理由相信此我们有理由相信RNAi必将对癌症的最终根治起到重必将对癌症的最终根治起到重要的作用要的作用 基因治疗肿瘤的策略 第四节第四节 核酶用于基因治疗核酶用于基因治疗  1983年美国Cech和Altmann发现并鉴定了一类具有酶催化作用的核苷酸片断，称为核酶(Ribozyme)这一发现使酶的概念从蛋白领域扩展到核酸领域核酶具有核苷酸内切酶的活性，它能在无核酶具有核苷酸内切酶的活性，它能在无蛋白质的条件下切割靶蛋白质的条件下切割靶RNA分子分子 基因治疗肿瘤的策略 核酶用于基因治疗的条件是核酶用于基因治疗的条件是 ①①找出肿瘤发生发展中关键性的蛋白质；找出肿瘤发生发展中关键性的蛋白质； ②②这种蛋白的氨基酸序列（和编码基因序这种蛋白的氨基酸序列（和编码基因序 列）必须是已知的，以便设计核酶的切列）必须是已知的，以便设计核酶的切 割位点；割位点； ③③所设计的核酶必须能够切割靶所设计的核酶必须能够切割靶RNA；； ④④肿瘤细胞必须能摄取这种核酶，肿瘤细胞必须能摄取这种核酶， 并能在细胞内切割靶并能在细胞内切割靶RNA。

基因治疗肿瘤的策略 反义治疗并不像刚开始人们所想像的反义治疗并不像刚开始人们所想像的那么简单，目前还有许多关键性问题有那么简单，目前还有许多关键性问题有待去解决，如生物学稳定性，药物的释待去解决，如生物学稳定性，药物的释放系统，以及由序列特异性和非特异性放系统，以及由序列特异性和非特异性所引起的作用包括毒副作用等应用反所引起的作用包括毒副作用等应用反义技术进行肿瘤基因治疗最常用的靶基义技术进行肿瘤基因治疗最常用的靶基因有因有Ha-ras、、c-myc、、c-fos、、c-jum、、c-erbB2等癌基因以及编码端粒酶基因，等癌基因以及编码端粒酶基因，或端粒酶的或端粒酶的RNA部分 基因治疗肿瘤的策略第五节第五节 抗肿瘤血管生成的基因治疗抗肿瘤血管生成的基因治疗  肿瘤的生长、转移与新生血管的形成密切相肿瘤的生长、转移与新生血管的形成密切相关关,由于肿瘤的血管生成受到血管生长因子、血管由于肿瘤的血管生成受到血管生长因子、血管生长抑制因子以及其它的因子的共同调控生长抑制因子以及其它的因子的共同调控,因此通因此通过阻断促血管生长因子作用或者强化血管生长抑过阻断促血管生长因子作用或者强化血管生长抑制因子的表达均可达到治疗的目的。

制因子的表达均可达到治疗的目的 基因治疗肿瘤的策略一、阻断血管生长因子的作用一、阻断血管生长因子的作用 主要是采用反义主要是采用反义DNA、中和性抗体、受体酪、中和性抗体、受体酪氨酸激酶的抑制剂以及核酶等氨酸激酶的抑制剂以及核酶等用腺病毒载体介导的用腺病毒载体介导的VEGF 的拮抗物输入鼠卵巢的拮抗物输入鼠卵巢癌抑制癌抑制VEGF 的活性的活性；；利用含有利用含有VEGF cDNA 的腺病毒载体转染乳腺癌的腺病毒载体转染乳腺癌细胞细胞,用以拮抗用以拮抗VEGF 的促血管生成作用的促血管生成作用；；用抗用抗VEGF 的核酶抑制的核酶抑制VEGF 的表达的表达,使卵巢癌使卵巢癌生长及血管生成减少的报告生长及血管生成减少的报告针对其它的血管生成因子的治疗针对其它的血管生成因子的治疗, 如如bFGF , 缺氧缺氧诱导因子诱导因子( HIF) , EGF , PDGF ,PDECGF ,IGF ,Ets-1 ,HGF 等的因子的治疗等的因子的治疗 基因治疗肿瘤的策略 Zhang等用等用VEGF siRNA特异性地抑制特异性地抑制VEGF的表达的表达,成成功地抑制小鼠卵巢癌上皮功地抑制小鼠卵巢癌上皮ID8细胞的增殖。

细胞的增殖TSP1是一种血是一种血管抑制因子管抑制因子,它可以抑制它可以抑制mmp9基因的激活基因的激活,从而抑制肿瘤的从而抑制肿瘤的生长一般说来生长一般说来,肿瘤细胞能够通过抑制肿瘤细胞能够通过抑制TSP1的表达来达到的表达来达到其指数增殖的目的通常情况下其指数增殖的目的通常情况下,VEGF能够抵制能够抵制TSP1的血的血管生长抑制作用管生长抑制作用Filleur等用等用VEGF siRNA转染肿瘤细胞转染肿瘤细胞,发现发现VEGF siRNA抑制效应可以与分泌抑制效应可以与分泌TSP1的肿瘤细胞协的肿瘤细胞协同作用同作用,抑制肿瘤的生长抑制肿瘤的生长,并且并且VEGF siRNA能阻止能阻止TSP1耐受耐受细胞的出现细胞的出现,并极大地抑制了这些细胞的生长速度并极大地抑制了这些细胞的生长速度 基因治疗肿瘤的策略二、上调血管生长抑制因子二、上调血管生长抑制因子 用重组血管抑素用重组血管抑素cDNA 输入消化道肿瘤输入消化道肿瘤可取得较好的治疗效果可取得较好的治疗效果,用编码内皮抑素的重组腺病毒载体可抑制内用编码内皮抑素的重组腺病毒载体可抑制内皮细胞迁移和皮细胞迁移和VEGF 介导的血管生成介导的血管生成,病毒载体介导的重组编码病毒载体介导的重组编码PF4 的反义基因显的反义基因显示出抗鳞癌血管生长的作用。

示出抗鳞癌血管生长的作用 基因治疗肿瘤的策略三三、、抑抑制制细细胞胞外外基基质质和和基基膜膜降降解解以以及及抑抑制制内内皮皮细胞特异性粘附分子的作用细胞特异性粘附分子的作用 用腺病毒载体介导的用腺病毒载体介导的T1MP-1 基因转染肿基因转染肿瘤细胞瘤细胞,瘤细胞产生的瘤细胞产生的T1MP-1 抑制了抑制了MMP-2 ,MMP-9 的活性的活性,使内皮细胞的迁移受到抑制使内皮细胞的迁移受到抑制Gondi 等采用双顺反子逆转录病毒载体介导的等采用双顺反子逆转录病毒载体介导的反义反义uPAR 和和uPA 治疗胶质瘤治疗胶质瘤,明显抑制了肿瘤明显抑制了肿瘤的血管生成的血管生成 基因治疗肿瘤的策略第五节第五节 、加大肿瘤细胞与正常细胞的天然差别、加大肿瘤细胞与正常细胞的天然差别 —— 自杀基因治疗自杀基因治疗自杀基因（自杀基因（suicide gene）治疗思路就是人为）治疗思路就是人为地改变肿瘤细胞的状态，将一些地改变肿瘤细胞的状态，将一些“自杀基因自杀基因”(TK基因、基因、CD基因和较新的细胞色素基因和较新的细胞色素p450-2B1基因基因)转导入肿瘤细胞中，这些基因所表达转导入肿瘤细胞中，这些基因所表达的产物能将原先对细胞无毒或相对低毒的物质的产物能将原先对细胞无毒或相对低毒的物质转变为细胞毒性物质，而引起到杀伤细胞的作转变为细胞毒性物质，而引起到杀伤细胞的作用。

用 基因治疗肿瘤的策略一、旁观者效应与机制一、旁观者效应与机制1、旁观者效应、旁观者效应(bystander effect)几几乎乎所所有有的的自自杀杀基基因因系系统统都都具具有有旁旁杀杀伤伤效效应应，，即即不不仅仅转转导导自自杀杀基基因因的的细细胞胞可可以以被被杀杀死死，，而而且且与与其其相相邻邻的的未未转转导导自自杀杀基基因因的的细细胞胞亦亦可可被被杀杀死死研研究究发发现现旁旁杀杀伤伤效效应应一一般般是是1：：10，，即即一一个个基基因因修修饰饰细细胞胞死死亡亡时时带带动动10个个基基因因未未修修饰饰细细胞胞死死亡亡，，由由此此可可见见“旁旁观观者者效效应应” 明显扩大了自杀基因的杀伤作用明显扩大了自杀基因的杀伤作用2、旁观者效应的可能机制、旁观者效应的可能机制⑴⑴ 磷酸化的巯基通过缝隙连接在同类细胞间传递；磷酸化的巯基通过缝隙连接在同类细胞间传递；⑵⑵自自杀杀基基因因（（TK-GCV））介介导导的的细细胞胞死死亡亡表表现现为为凋凋亡亡，，临临近近未未转转染细胞吞噬凋亡小体，而凋亡小体内含有染细胞吞噬凋亡小体，而凋亡小体内含有GCV三磷酸代谢产物；三磷酸代谢产物；⑶⑶ 自自杀杀基基因因可可使使肿肿瘤瘤从从免免疫疫抑抑制制转转变变为为免免疫疫刺刺激激，，包包括括各各种种细细胞因子释放和免疫细胞浸润的级联反应；胞因子释放和免疫细胞浸润的级联反应；⑷⑷ 死亡细胞中抗原暴露，被周围死亡细胞中抗原暴露，被周围APC摄取而产生抗肿瘤免疫。

摄取而产生抗肿瘤免疫 基因治疗肿瘤的策略二、靶向基因表达和治疗二、靶向基因表达和治疗 应用自杀基因进行基因治疗时，首先要求转染的自应用自杀基因进行基因治疗时，首先要求转染的自杀基因要有一定的表达效率其次，导入的基因要局限杀基因要有一定的表达效率其次，导入的基因要局限于靶细胞，常用的病毒载体导入法能较好地解决这个问于靶细胞，常用的病毒载体导入法能较好地解决这个问题增加病毒载体靶向性的一种重要策略就是利用肿瘤题增加病毒载体靶向性的一种重要策略就是利用肿瘤特异性调控元件去调节自杀基因的表达肿瘤细胞内具特异性调控元件去调节自杀基因的表达肿瘤细胞内具有特异性转录激活因子，能激活特定蛋白的转录表达，有特异性转录激活因子，能激活特定蛋白的转录表达，而转录激活的作用是通过结构基因上游的特异性调控序而转录激活的作用是通过结构基因上游的特异性调控序列起作用，正常细胞内无此类特定的转录激活因子因列起作用，正常细胞内无此类特定的转录激活因子因此，当正常细胞和肿瘤细胞都被转染特异调控序列控制此，当正常细胞和肿瘤细胞都被转染特异调控序列控制的外源性目的基因后，肿瘤细胞内的特异性调控序列可的外源性目的基因后，肿瘤细胞内的特异性调控序列可被激活，表达目的基因，从而达到靶向基因表达和治疗被激活，表达目的基因，从而达到靶向基因表达和治疗的目的，正常细胞则不能表达。

的目的，正常细胞则不能表达 基因治疗肿瘤的策略在各种调控序列中，组织特异性启动子常被用作启动目的基在各种调控序列中，组织特异性启动子常被用作启动目的基因在靶组织中高度表达，如甲胎蛋白基因启动子（因在靶组织中高度表达，如甲胎蛋白基因启动子（pAFP）、）、癌胚抗原启动子（癌胚抗原启动子（pCEA）、白蛋白启动子（）、白蛋白启动子（pALB）、骨钙）、骨钙化蛋白启动子（化蛋白启动子（pUL）、前列腺特异抗原启动子（）、前列腺特异抗原启动子（psA）等如使用新型的载体如使用新型的载体KD1-SPB[KD1是伴有代替表面活性蛋白是伴有代替表面活性蛋白B（（surfactant protein B SPB）的）的E4促动子促动子]，在成熟，在成熟ⅡⅡ型肺型肺泡上皮和支气管上皮癌中泡上皮和支气管上皮癌中SPB促动子的活性受到限制，因为促动子的活性受到限制，因为KD-SPB中有中有E1A突变，因此它仅能作用于肺和支气管的癌细突变，因此它仅能作用于肺和支气管的癌细胞KD1-SPB在肝癌治疗中抑制肿瘤生长表明腺病毒载体在肝癌治疗中抑制肿瘤生长表明腺病毒载体在癌治疗中能针对组织特异性肿瘤具有选择性的复制能力。

在癌治疗中能针对组织特异性肿瘤具有选择性的复制能力 基因治疗肿瘤的策略三三、、将将“毒毒性性”基基因因导导入入肿肿瘤瘤细细胞胞杀杀死死肿肿瘤瘤细细胞胞 这这些些基基因因通通常常编编码码的的是是一一种种酶酶，，这这种种酶酶可可使使无无毒毒的的前前药药转转化化为为有有毒毒的的代代谢谢产产物物，，从从而而使使转转导导细细胞胞死死亡亡，，因因此此通通常常也也称称为为酶酶/前前药药系系统统最最近近，，Nagy等等在在实实验验兔兔中中使使用用逆逆转转录录的的单单纯纯疱疱疹疹病病毒毒胸胸苷苷激激酶酶基基因因（（Herpes simdex virus-thymidine kinase HSV-TK））作作为为自自杀杀基基因因治治疗疗卵卵巢巢癌癌能能引引起起该该肿肿瘤瘤退退化化HSV－－TK可可使使核核苷苷类类似似物物磷磷酸酸化化，，然然后后代代替替核核苷苷整整合合到到DNA链链中中，，从从而而使使细细胞胞死死亡亡肿肿瘤瘤细细胞胞导导入入HSV－－TK后后，，高高表表达达TK，，使使细细胞胞内内毒毒性性产产物物集集聚聚而而死死亡亡在在不不到到20％％的的肿肿瘤瘤细细胞胞导导入入TK后后，，用用前前药药GCV会会引引起起80％的肿瘤细胞死亡这是旁观者效应所引起的。

％的肿瘤细胞死亡这是旁观者效应所引起的 基因治疗肿瘤的策略 我国学者颜子颖利用我国学者颜子颖利用AFP基因上游调控序列基因上游调控序列构建了一种肝癌细胞特异表达的构建了一种肝癌细胞特异表达的EB病毒复制子病毒复制子载体，成功地实现了肝癌细胞中基因转移的靶载体，成功地实现了肝癌细胞中基因转移的靶向性由于脑的神经细胞已高度分化，只有肿向性由于脑的神经细胞已高度分化，只有肿瘤细胞处于活化分裂状态，因此脑肿瘤是自杀瘤细胞处于活化分裂状态，因此脑肿瘤是自杀基因较理想的靶器官，对于脑肿瘤中最常见的基因较理想的靶器官，对于脑肿瘤中最常见的神经胶质瘤的治疗中，神经胶质瘤的治疗中，HSV-TK/GCV首先由美首先由美国国NFH的的Ram及及Calver小组于小组于1992年报道，在年报道，在动物实验及动物脑肿瘤中非常理想，于动物实验及动物脑肿瘤中非常理想，于1992年年7月获得月获得FDA批准进入临床试验阶段批准进入临床试验阶段基因治疗肿瘤的策略 国内也有报道用大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶国内也有报道用大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶（（cytosine deaminase CD）自杀基因系统治疗胶）自杀基因系统治疗胶质瘤。

质瘤CD仅存在真菌与细菌中哺乳类动物无，仅存在真菌与细菌中哺乳类动物无，CD可将胞嘧啶脱氨基变为尿嘧啶，可使可将胞嘧啶脱氨基变为尿嘧啶，可使5-Fc脱氨基转脱氨基转变为变为5-Fu，而，而5-Fu作为化疗药物抑制作为化疗药物抑制DNA合成，合成，CD基因是第二个用于人体的肿瘤自杀基因基因是第二个用于人体的肿瘤自杀基因基因治疗肿瘤的策略 HSV-TK/GCV自杀基因系统还常常用自杀基因系统还常常用于成神经管细胞瘤，脑膜转移瘤等脑肿瘤于成神经管细胞瘤，脑膜转移瘤等脑肿瘤的治疗此外，自杀基因治疗也普遍应用的治疗此外，自杀基因治疗也普遍应用于肝癌、肺癌、结肠癌、甲状腺癌、腹膜于肝癌、肺癌、结肠癌、甲状腺癌、腹膜癌等肿瘤的治疗中，它对那些恶性易复发、癌等肿瘤的治疗中，它对那些恶性易复发、疗效差和无法根治的肿瘤是一种较为理想疗效差和无法根治的肿瘤是一种较为理想的治疗方法的治疗方法 基因治疗肿瘤的策略四四、、自自杀杀基基因因与与免免疫疫基基因因的的联联合合治治疗疗将将产产生生更更好的疗效好的疗效 研究发现单用研究发现单用HSV-TK/GCV治疗，可使肿瘤比对治疗，可使肿瘤比对照组小照组小5倍以上，而联用倍以上，而联用IL-2基因或基因或IL-12基因能使肿基因能使肿瘤完全消失并抑制转移。

将瘤完全消失并抑制转移将IL-2基因、基因、GM-CSF基因基因和和HSV-TK基因三者合用可取得更好的效果基因三者合用可取得更好的效果IFN-αα基因与基因与HSV-TK/GCV系统联合治疗，可使系统联合治疗，可使70%以上的以上的鼠白血病肿瘤消退，并明显延长鼠成活时间，而单纯鼠白血病肿瘤消退，并明显延长鼠成活时间，而单纯IFN-αα只延长鼠成活时间，不能使肿瘤消退，单纯只延长鼠成活时间，不能使肿瘤消退，单纯HSV-TK/GCV只暂时抑制肿瘤的生长和略微延长鼠成只暂时抑制肿瘤的生长和略微延长鼠成活时间基因治疗肿瘤的策略自杀基因治疗对免疫功能的激发作用自杀基因治疗对免疫功能的激发作用①①诱导炎症细胞浸润（诱导炎症细胞浸润（T细胞、单核细胞、细胞、单核细胞、中性粒细胞）；中性粒细胞）；②②诱导细胞因子的分泌（诱导细胞因子的分泌（IL-1、、TNF-αα、、IL-1αα、、IL-6、、mRNA在治疗后第在治疗后第2天开始表天开始表达达,而而IFN-γγ、、GM-CSF在治疗后第在治疗后第2天开始天开始表达，到治疗后第表达，到治疗后第4天仍有表达，其中以天仍有表达，其中以TNF-γγ表达升高最明显）。

表达升高最明显）基因治疗肿瘤的策略第六节第六节 提高化疗效应提高化疗效应——耐药基因治疗耐药基因治疗 肿瘤化疗中最难处理的问题之一肿瘤化疗中最难处理的问题之一 就是出现瘤就是出现瘤细胞对许多常用化疗药物产生抗药性和交叉抗药细胞对许多常用化疗药物产生抗药性和交叉抗药性，有些肿瘤开始敏感，但经过一段时间后出现性，有些肿瘤开始敏感，但经过一段时间后出现耐药性耐药性,这种耐药性常表现为肿瘤细胞对多种结构这种耐药性常表现为肿瘤细胞对多种结构不同、作用靶位不同、作用方式不同的抗肿瘤药不同、作用靶位不同、作用方式不同的抗肿瘤药物具有抵抗性物具有抵抗性,称为多药耐药称为多药耐药(multidruge resistance,MDR) 基因治疗肿瘤的策略自自1970年年Bieuler等首次报道交叉耐药现象以来，针对等首次报道交叉耐药现象以来，针对肿瘤耐药基因治疗日益活跃，主要集中在两个方面肿瘤耐药基因治疗日益活跃，主要集中在两个方面1、、MDR的形成机制的形成机制2 2、如何利用、如何利用MDR基因来抵制晚期肿瘤患者化疗时出基因来抵制晚期肿瘤患者化疗时出现的骨髓抑制现的骨髓抑制 研究发现研究发现,这种耐药性与肿瘤细胞的某些耐药基这种耐药性与肿瘤细胞的某些耐药基因相关因相关。

多药耐药基因多药耐药基因1(MDR1),编码相对分子质量为编码相对分子质量为170000的跨膜糖蛋白的跨膜糖蛋白P-gp/P-170具有药泵的作用具有药泵的作用,当当其表达增高或功能异常增强时其表达增高或功能异常增强时,能将肿瘤细胞内的药能将肿瘤细胞内的药物物“泵泵”出细胞外出细胞外,使细胞能在高浓度的药物环境中使细胞能在高浓度的药物环境中生存针对该基因的生存针对该基因的RNAi可以使可以使MDR1基因的水平基因的水平下调，提高细胞内的药物浓度下调，提高细胞内的药物浓度,提高肿瘤细胞对化疗提高肿瘤细胞对化疗的敏感性的敏感性 基因治疗肿瘤的策略Nieth等通过等通过anti-MDR1-siRNA 成功抑制了人胰成功抑制了人胰腺癌细胞株（腺癌细胞株（EPP85-181RDB）和胃癌细胞株）和胃癌细胞株（（EPG85-257RDB）的）的MDR1基因及其表达产基因及其表达产物物,抑制效率达抑制效率达91%,两种细胞对柔红霉素的耐药两种细胞对柔红霉素的耐药性抵抗分别降低了性抵抗分别降低了58%和和89%表明此种表明此种siRNA也可以试用于肿瘤的治疗也可以试用于肿瘤的治疗,通过提高细胞对抗肿通过提高细胞对抗肿瘤药物的敏感性来达到治疗肿瘤的目的。

瘤药物的敏感性来达到治疗肿瘤的目的 基因治疗肿瘤的策略一一些些应应用用多多药药耐耐药药基基因因（（MDR1））转转染染保保护护骨骨髓髓造造血血细细胞胞的的基基因因治治疗疗项项目目已已进进入入临临床床试试验验阶阶段段如如将将针针对对化化疗疗药药物物的的MDR转转染染至至肿肿瘤瘤患患者者的的骨骨髓髓造造血血干干细细胞胞(Hemopoietic Stim Cell ，，HSC)，，使使其其具具有有比比肿肿瘤瘤更更强强的的化化疗疗药药物物耐耐受受力力，，可可以以提提高高临临床床化化疗疗剂剂量量和和时时间间，，而而减减轻轻化化疗疗最最主主要要的的副副作作用用——对对骨骨髓髓细细胞胞的的损损害害临临床床常常用用于于骨骨髓髓未未受受侵侵犯犯的的乳乳腺腺癌癌、、卵卵巢巢癌癌和和各各种种脑脑部部肿肿瘤瘤患患者者的的治治疗疗，，因因为为这这些些肿肿瘤瘤细细胞胞中中较较少少检检测测到到内内在在MDR1的的表表达达，，而而且且即即使使接接触触MDR1的的药药物物，，其其表表达达水水平平仍仍明明显显低低于于转转基基因因的造血细胞表达水平的造血细胞表达水平基因治疗肿瘤的策略 据报道，据报道，20例晚期乳腺癌或卵巢癌患者经例晚期乳腺癌或卵巢癌患者经此治疗有此治疗有8例获完全缓解，例获完全缓解，9例获部分缓解，完例获部分缓解，完全缓解中位时间为全缓解中位时间为10个月。

个月一些新的耐药基因，如突变的二氢叶酸还原酶一些新的耐药基因，如突变的二氢叶酸还原酶（（MDHFR）、甲基鸟嘌呤甲基转移酶）、甲基鸟嘌呤甲基转移酶（（MGMT）、谷胱苷肽）、谷胱苷肽-S-转移酶（转移酶（GST）、醛）、醛脱氢酶（脱氢酶（ALDH）等被用于肿瘤耐药基因的治）等被用于肿瘤耐药基因的治疗 通过用耐药基因转染保护骨髓造血细胞是通过用耐药基因转染保护骨髓造血细胞是一种特殊方式的肿瘤基因疗法，用于克服化疗一种特殊方式的肿瘤基因疗法，用于克服化疗的骨髓抑制作用效果显著，临床应用潜力很大的骨髓抑制作用效果显著，临床应用潜力很大基因治疗肿瘤的策略 在肿瘤治疗中多在肿瘤治疗中多数抗癌药物是促进数抗癌药物是促进细胞凋亡的，而癌细胞凋亡的，而癌细胞的耐药是化疗细胞的耐药是化疗中最棘手的问题中最棘手的问题在报道中将在报道中将BCl-2转入癌细胞则癌细转入癌细胞则癌细胞变为耐药，目前胞变为耐药，目前从凋亡角度来研究从凋亡角度来研究肿瘤的耐药性，可肿瘤的耐药性，可能找到新的解决方能找到新的解决方法基因治疗肿瘤的策略多药耐药（多药耐药（MDR）的检测帮助临床选择有效的抗癌药物）的检测帮助临床选择有效的抗癌药物 ①① 胚胚胎胎型型谷谷胱胱甘甘肽肽-S-转转移移酶酶（（GsTπ）），，是是肿肿瘤瘤细细胞胞产产生生耐耐药药的的一一种种标标记记，，对对顺顺铂铂类类化化疗疗药药物物产产生生耐耐药药，，用用于于肝肝癌癌、、胃癌、胰腺癌、结肠癌、食道癌治疗。

胃癌、胰腺癌、结肠癌、食道癌治疗②② 热休克蛋白（热休克蛋白（HSPs）是细胞受应激原刺激后产生的一）是细胞受应激原刺激后产生的一组应激蛋白，与肿瘤发生、增殖及分化有关按其分子量组应激蛋白，与肿瘤发生、增殖及分化有关按其分子量有有3种类型HPS27与肿瘤耐药和肿瘤分化有关，与肿瘤耐药和肿瘤分化有关，HPS60主要用于舌鳞癌、结肠癌、胰腺癌和乳腺癌的研究，主要用于舌鳞癌、结肠癌、胰腺癌和乳腺癌的研究，具有预后意义具有预后意义HPS90可能参与细胞凋亡、可能参与细胞凋亡、DNA损伤修复损伤修复 基因治疗肿瘤的策略③③ P-糖蛋白（糖蛋白（P-gP）是多药耐药（）是多药耐药（MDR）基因的产物，）基因的产物，是转膜蛋白，被称为是转膜蛋白，被称为“药物流出泵药物流出泵”，或，或“膜泵糖蛋膜泵糖蛋白白”，转膜蛋白是个活跃的转运者，排出细胞内毒物，转膜蛋白是个活跃的转运者，排出细胞内毒物与药物通过与药物通过ATP供能，将已进入细胞内的药物从细胞供能，将已进入细胞内的药物从细胞内泵出到细胞外，降低细胞内抗癌药物的浓度，减少内泵出到细胞外，降低细胞内抗癌药物的浓度，减少对细胞的毒性作用对细胞的毒性作用。

P糖蛋白表达程度与耐药程度成正比，与化疗效果，糖蛋白表达程度与耐药程度成正比，与化疗效果，生存期成反比在原发性乳腺癌中生存期成反比在原发性乳腺癌中P糖蛋白表达很低，糖蛋白表达很低，但经过治疗后可升高，但经过治疗后可升高， 这可能是由于细胞选择性的耐这可能是由于细胞选择性的耐受药物，一旦有受药物，一旦有P 基因扩增，常伴有肿瘤进展基因扩增，常伴有肿瘤进展 现已表明一些钙通道阻断剂，如硝苯吡啶，现已表明一些钙通道阻断剂，如硝苯吡啶， 维拉维拉帕米，异搏定和免疫抑制剂等均可转化帕米，异搏定和免疫抑制剂等均可转化MDR表型，抑表型，抑制制P糖蛋白的膜泵作用，糖蛋白的膜泵作用， 增加癌细胞内化疗药物的积聚，增加癌细胞内化疗药物的积聚，使抗癌药物杀伤能力增强使抗癌药物杀伤能力增强P-gP易产生耐药的抗癌药物主要是长春花碱、长春新易产生耐药的抗癌药物主要是长春花碱、长春新碱类和阿霉素碱类和阿霉素 基因治疗肿瘤的策略④④ DNA拓拓扑扑异异构构酶酶Ⅱ（（TopoⅡ））在在正正常常细细胞胞DNA合合成成与与分分裂裂时时起起作作用用，，是是细细胞胞周周期期S-G2-M期期中中敏敏感感而而特特异异的的标标记记，，其其含含量量高高低低与与抗抗癌癌药药物物的的作作用用呈呈正正比比，，是是抗抗癌癌药药物物的的作作用用靶靶点点，，当当肿肿瘤瘤细细胞胞TopoⅡ表表达达下下降降产产生生对对TopoⅡ抑抑制制剂剂类类化化疗疗药药物物（（阿阿霉霉素素及及鬼鬼臼臼乙乙叉叉甙等）产生耐药。

甙等）产生耐药⑤⑤ 其它的耐药预测物有：乳腺癌其它的耐药预测物有：乳腺癌C-erbB-2过表达对过表达对含有环磷酰胺、氨甲蝶呤和氟尿嘧啶的化疗方案耐药；含有环磷酰胺、氨甲蝶呤和氟尿嘧啶的化疗方案耐药；N-myc表达增强的小细胞肺癌和神经母细胞瘤对化疗表达增强的小细胞肺癌和神经母细胞瘤对化疗缺乏反应并进展快速；缺乏反应并进展快速；Bcl-2耐药机制为抗凋亡作用，耐药机制为抗凋亡作用，高表达者对多数抗癌药物、放射治疗耐受因此这方高表达者对多数抗癌药物、放射治疗耐受因此这方面的免疫组化检测对肿瘤病人选择化疗方案和预后判面的免疫组化检测对肿瘤病人选择化疗方案和预后判断具有重要的临床意义断具有重要的临床意义 基因治疗肿瘤的策略第七节第七节 　肿瘤基因治疗研究面临的主要问题　肿瘤基因治疗研究面临的主要问题  基因治疗是基因治疗是21世纪治疗恶性肿瘤的重要手段世纪治疗恶性肿瘤的重要手段一、基因导入的载体系统一、基因导入的载体系统 目前所采用的载体主要分为转染性和转导性载体目前所采用的载体主要分为转染性和转导性载体 转染性载体是利用化学或物理方法增加细胞膜的通转染性载体是利用化学或物理方法增加细胞膜的通透性而将透性而将DNA 转染入细胞内转染入细胞内,包括脂质体和基因枪等。

包括脂质体和基因枪等 转导性载体则是利用病毒对细胞的天然亲和力把遗转导性载体则是利用病毒对细胞的天然亲和力把遗传物质引入宿主细胞传物质引入宿主细胞 转染的方法相对简易转染的方法相对简易,抗原性弱但效率较低抗原性弱但效率较低,而且基因而且基因表达的持久性不够因此它在肿瘤基因治疗中的使用受表达的持久性不够因此它在肿瘤基因治疗中的使用受到限制转导法则效率高到限制转导法则效率高,作用持久作用持久,但抗原性较强但抗原性较强,目前大目前大多数基因治疗程序仍以病毒介导逆转录病毒是目前最多数基因治疗程序仍以病毒介导逆转录病毒是目前最为成熟、运用最广的进行基因转移的载体系统为成熟、运用最广的进行基因转移的载体系统 基因治疗肿瘤的策略 迄迄今今为为止止人人类类基基因因治治疗疗的的载载体体,约约60 %是是用用复复制制缺缺陷陷型型的的逆逆转转录录病病毒毒, 最最广广泛泛使使用用的的是是Moloney 鼠鼠白白血血病病病病毒毒MoMuLV其其生生物物学学特特性性为为:可可感感染染分分裂裂细细胞胞;可可整整合合到到宿宿主主染染色色体体中中;表达时间较长表达时间较长 优优点点：：受受体体分分布布广广泛泛,几几乎乎存存在在所所有有的的人人类类细细胞胞上上,因因而而对对细细胞胞的的感感染染谱谱广广,特特别别是是对对分分裂裂细细胞感染效率较高。

胞感染效率较高 缺缺点点:仅仅整整合合到到处处于于增增殖殖状状态态的的细细胞胞;允允许许插插入入的的的的外外源源基基因因< 8 kb ,随随机机整整合合插插入入有有诱诱变变危危险险,组织或细胞选择性不高等组织或细胞选择性不高等基因治疗肿瘤的策略 近年来近年来,国外学者力求通过新型靶向性载体及包装细国外学者力求通过新型靶向性载体及包装细胞的设计来克服逆转录病毒特异性低的缺陷腺病毒载胞的设计来克服逆转录病毒特异性低的缺陷腺病毒载体是目前常用的载体体是目前常用的载体,转导效率高转导效率高,容易生产容易生产,抗原性较强抗原性较强,体内应用高滴度腺病毒重组体体内应用高滴度腺病毒重组体,会引起对转导细胞免疫排会引起对转导细胞免疫排斥及炎症反应等斥及炎症反应等 以腺病毒相关病毒以腺病毒相关病毒(AAV) 为基础的载体已引起基因治为基础的载体已引起基因治疗界的重视疗界的重视AAV 载体具有长期稳定整合、低水平表达载体具有长期稳定整合、低水平表达特点特点,适用于表达生物活性物质的基因适用于表达生物活性物质的基因,在高滴度情况下也在高滴度情况下也未发现引起炎症的不良反应。

它有可能弥补逆转录病毒未发现引起炎症的不良反应它有可能弥补逆转录病毒及腺病毒的缺点而在基因治疗中起到特有的作用及腺病毒的缺点而在基因治疗中起到特有的作用 AAV 的主要局限是难以大量生产和载体容量有限的主要局限是难以大量生产和载体容量有限,但但新的复制模型有望解决这些问题新的复制模型有望解决这些问题基因治疗肿瘤的策略二、基因治疗的靶向性策略二、基因治疗的靶向性策略带带有有目目的的基基因因的的载载体体如如何何到到达达“靶靶细细胞胞”是是肿肿瘤瘤基基因因治治疗疗的的关关键键只只有有提提高高基基因因转转导导的的靶靶向向性性,才才能能实实现现治治疗疗的的针针对对性和安全性性和安全性目前解决基因的靶向转移及表达有目前解决基因的靶向转移及表达有3 种策略种策略⑴⑴ 用用基基因因工工程程手手段段改改造造基基因因载载体体,如如改改造造逆逆转转录录病病毒毒包包装装细细胞胞中中的的原原病病毒毒env 序序列列,使使所所包包装装的的重重组组病病毒毒特特异异地地识识别别位位于靶细胞表面的抗原或受体决定簇于靶细胞表面的抗原或受体决定簇;⑵⑵ 在在体体内内基基因因传传递递系系统统中中共共价价连连接接抗抗瘤瘤抗抗体体和和肿肿瘤瘤细细胞胞特特异异受受体体的的配配基基,使使基基因因在在类类似似“生生物物导导弹弹”作作用用下下被被送送到到肿肿瘤细胞表面瘤细胞表面;⑶⑶ 应用肿瘤细胞特异蛋白应用肿瘤细胞特异蛋白“管家基因管家基因”的基因表面调控元的基因表面调控元件件,在转录水平调控目的基因在靶细胞中特异表达。

国外已在转录水平调控目的基因在靶细胞中特异表达国外已开始针对开始针对VEGF、、VEGF-R1、、VEGF-R2 设计反义基因或调设计反义基因或调控控VEGF 的基因作为目的基因的基因作为目的基因,这种思路很有发展前途这种思路很有发展前途 基因治疗肿瘤的策略三、外源基因在体内表达的可控性三、外源基因在体内表达的可控性 外源基因导入后外源基因导入后,在体内的表达若能人为调控在体内的表达若能人为调控,将对将对恶性肿瘤及诸多疾病的基因治疗有所突破目前已经发恶性肿瘤及诸多疾病的基因治疗有所突破目前已经发现了一个可诱导的调控系统现了一个可诱导的调控系统—TAXI/UAS 系统该系统系统该系统应用一个酵母应用一个酵母GAL4 的顺式元件作为外源基因的上游的顺式元件作为外源基因的上游,另另组建一个激素受体组建一个激素受体(孕酮孕酮) 及一段及一段GAL4 的反调控基因子的反调控基因子的嵌体的嵌体,将两个载体共转染靶细胞后将两个载体共转染靶细胞后,只有当诱导物只有当诱导物(孕酮孕酮) 或其拮抗物或其拮抗物(米非司酮米非司酮) 存在时存在时,目的基因才能表达目的基因才能表达 基因治疗肿瘤的策略四、其他原因四、其他原因⑴⑴ 某某些些体体内内原原代代细细胞胞转转基基因因及及基基因因表表达达水水平平往往往不及体外建株细胞；往不及体外建株细胞；⑵⑵ 靶基因在体内表达持续时间较短；靶基因在体内表达持续时间较短；⑶⑶ 在在处处理理多多系系统统基基因因紊紊乱乱过过程程中中基基因因治治疗疗的的作作用远未清楚；用远未清楚；⑷⑷ 基因治疗刚开始用于人体实验，其长期疗效基因治疗刚开始用于人体实验，其长期疗效和不良作用尚不清楚，有待于大量的实验研究和不良作用尚不清楚，有待于大量的实验研究 基因治疗肿瘤的策略 尽尽管管在在体体内内载载体体的的转转导导与与表表达达率率尚尚不不够够理理想想，，临临床床上上还还没没有有较较全全面面的的成成功功经经验验，，但但面面对复杂的基因治疗，目前研究重点策略在于对复杂的基因治疗，目前研究重点策略在于①①增强对肿瘤的免疫反应。

增强对肿瘤的免疫反应②②修修复复细细胞胞周周期期中中由由肿肿瘤瘤抑抑制制基基因因丧丧失失或或癌癌基因激活而造成的细胞基因激活而造成的细胞DNA损伤③③自自杀杀基基因因的的策策略略还还有有基基因因标标记记研研究究与与在在基基因治疗中对正常组织的保护措施等因治疗中对正常组织的保护措施等 只只有有解解决决了了这这一一系系列列问问题题后后，，基基因因治治疗疗才才能真正用于临床，造福于肿瘤患者能真正用于临床，造福于肿瘤患者基因治疗肿瘤的策略。