醋酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白实验报告.docx

为了适应公司新战略的发展，保障停车场安保新项目的正常、顺利开展，特制定安保从业人员的业务技能及个人素质的培训计划醋酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白实验报告　　前言　　血清蛋白：　　血清蛋白是血液中脂肪酸的携带者当身体需要能量或者需要建造材料时，脂肪细胞就把脂肪酸释放到血液中，脂肪酸被血清蛋白获取，并被运送到需要的部位　　牛血清白蛋白的相对分子质量为10的4次方这个级别，它不是一定的，是多聚物，有的地方测的70000，这就是一个数据了在做PCR的时候会用到它　　牛血清蛋白是血液的主要成分，分子量68kD含氮量16%，含糖量%仅含已糖和已糖胺，含脂量只有%白蛋白由581个氨基酸残基组成，其中35个半胱氨酸组成17个二硫键，在肽链的第34位有一自由巯基白蛋白可与多种阳离子、阴离子和其他小分子物质结合血液中的白蛋白主要起维持渗透压作用、PH缓冲作用、载体作用和营养作用在动物细胞无血清培养中，添加白蛋白可起到生理和机械保护作用和载体作用　　醋酸纤维薄膜电泳：　　醋酸纤维薄膜电泳以醋酸纤维薄膜为支持物它是纤维素的醋酸酯，由纤维素的羟基经乙酰化而制成它溶于丙酮等有机溶液中，即可涂布成均一细密的微孔薄膜，厚度以—为宜。

太厚吸水性差，分离效果不好；太薄则膜片缺少应有的机械强度则易碎　　应用醋酸纤维薄膜电泳操作简单、快速、廉价已经广泛用于血　　清蛋白，血红蛋白，球蛋白，脂蛋白，糖蛋白，甲胎蛋白，类固醇激素及同工酶等的分离分析中，尽管它的分辨力比聚丙酰胺凝胶电泳低，但它具有简单，快速等优点　　特点：　　1.醋酸纤维薄膜对蛋白质样品吸附极少，无“拖尾”现象，染色后背景能完全脱色，各种蛋白质染色带分离清晰，因而提高了测定的精确性　　快速省时由于醋酸纤维薄膜亲水性较滤纸小，薄膜中所容纳的缓冲液也较少，电渗作用小，电泳时大部分电流是由样品传导的，所以分离速度快，电泳时间短，一般电泳45—60min即可，加上染色，脱色，整个电泳完成仅需90min左右　　灵敏度高，样品用量少血清蛋白仅需2μl血清，甚至加样体积少至μl，仅含5μg蛋白样品也可得到清晰的分离带临床医学检验利用这一点，检测在病理情况下微量异常蛋白的改变　　应用面广某些蛋白在纸上电泳不易分离，如胎儿甲种球蛋白，溶菌酶，胰岛素，组蛋白等用醋酸纤维薄膜电泳能较好地分离　　醋酸纤维薄膜电泳染色后，经冰乙酸，乙醇混合液或其它溶液浸泡后可制成透明的干板，有利于扫描定量及长期保存。

　　2、醋酸纤维薄膜电泳与聚丙烯酰胺凝胶电泳相比，操作简单，但分离效果不太好如血清蛋白在醋酸纤维素薄膜电泳中，只能分离出5—6条区带，而聚丙烯酰胺凝胶电泳可分离出数10条区带　　一、实验目的　　1.掌握电泳法分离血清蛋白质的原理；　　2.掌握血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳的操作方法　　二、实验原理　　1.电泳：是指带电粒子在电场中向本身所带电荷相反的电极移动的现象　　在一定pH条件下，不同的蛋白质由于具有不同的等电点而带不同性质的电荷，因而在一定的电场中它们的移动方向和移动速度也不同，即它们的电泳迁移率不同，因此，可使它们分离　　2.影响电泳迁移率的因素：　　内在因素：蛋白所带净电荷的量、蛋白的大小和形状　　外界因素：电场强度、溶液的pH值、溶液的离子强度和电渗现象　　3.血清中各种蛋白质的等电点在～之间，在的缓冲溶液中均带负电荷，在电场中向正极泳动血清中各种蛋白质的等电点不同，所以带电荷量也不同此外各种蛋白质的分子大小各有差异，因此在同一电场中泳动的速度不同分子小而带电荷多者，泳动较快；反之，则较慢　　4.醋酸纤维素溶于有机溶剂后，涂抹成均匀的薄膜则成为醋酸纤维素薄膜该膜具有均一的泡沫状的结构，厚度约为120μm，有很强的通透性，对分子移动阻力很小。

该薄膜电泳具有微量、快速、简便、分辨力高，对样品无　　拖尾和吸附现象等优点现已广泛用于血清蛋白、糖蛋白、脂蛋白、血红蛋白、酶的分离和免疫电泳等方面　　5.经醋酸纤维素薄膜电泳可将血清蛋白按电泳速度分为5条区带，从正极端依次为清蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白及γ球蛋白，经染色可计算出各蛋白质的百分含量　　三、实验材料及试剂　　1、实验器材　　1.电泳仪：为电泳提供直流电源　　2.电泳槽：为电泳提供场所　　3.血清加样器：可用盖玻片或微量加样器　　4.醋酸纤维素薄膜：2cm×8cm　　5.其它：培养皿、滤纸、镊子等　　2、实验材料及试剂　　材料：牛血清　　1.巴比妥-巴比妥钠缓冲液()　　%氨基黑10B染色液　　3.漂洗液　　4.透明液：临用前配制　　甲液：取冰乙酸15ml，无水乙醇85ml，乙液：取冰乙酸25ml，无水乙醇75ml　　5.保存液：液体石蜡　　6.定量洗脱液　　四、实验步骤　　1、电泳槽的准备　　电泳槽有两个互相隔离的槽，各自装有缓冲液，接不同的电极，红色为正极，黑色为负极每个槽上都有一根可移动的横杆，滤纸的一头搭在横杆上，另一头浸入缓冲液中，形成了滤纸桥点好样的醋酸纤维薄膜就搭在滤纸桥上。

　　2、醋酸纤维素薄膜的润湿　　将醋酸纤维素薄膜完全浸泡于缓冲液中约30min后，用镊子小心夹住薄膜一端，放在折叠的滤纸中，并用滤纸吸干表面液体　　3、点样　　把膜条铺在玻璃板上，将点样器在血清中沾一下，再在膜条一端处轻轻水平地落下并随即提起，这样即在膜条上点上了细条状的血清样品此步是实验的关键　　4、电泳　　将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸桥上实验目的：　　1.学习醋酸纤维薄膜电泳原理　　2.掌握血清醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质的技术　　3.熟悉血清蛋白组分定量方法，并确定血清中蛋白与球蛋白的比值　　实验原理：　　血清绝大多数蛋白质的等电点在～在的巴比妥缓冲液中，　　血清蛋白全部带负电荷，在直流电场中向正电极移动，移动的速度与带电蛋白质颗粒所带电荷成正比，与蛋白质颗粒的大小成反比如果样品点在醋酸纤维薄膜的同一条线上，电泳相同的时间，不同的蛋白质颗粒移动的距离不同，通过染色，薄膜条上的血清的蛋白质被分离成不同的条带将此薄膜条透明，可以进行扫描，或将色带剪下，将颜色洗脱，进行比色，都能获得各色带所含蛋白质占血清总蛋白的百分比，并可计算血清中清蛋白／球蛋白比值，正常值为～　　实验材料与仪器：　　1．实验仪器材料：1、醋酸纤维薄膜2、人血清；3、烧杯及培养皿数只；4、x光片；5、镊子；6、试管六只；7、电泳槽；8、直流稳压电泳仪；9、7220型分光光度计；10、剪刀　　2．实验试剂：1、巴比妥-巴比妥钠缓冲液：取两个大烧杯，分别称取巴比妥钠和巴比妥溶解于500ml蒸馏水中；2、染色液，可反复使用；3、漂洗液：取乙醇45ml，冰醋酸10ml，混匀；4、浸出液：/LNaOH溶液；实验步骤：　　1、准备和点样　　取一条醋酸纤维薄膜，侵入缓冲液中，完全侵泡后，用镊子轻轻取出，将薄膜无光泽的一面向上，平放在干净滤纸上，再放一张干净滤纸吸取多余的缓冲液。

用X光片蘸取少量血清，然后轻轻于距离薄膜端处接触，样品即成一条线突于纤维膜上待血清透入膜内，将薄膜放在电泳槽上　　2、电泳　　接通电源，设定电泳电压为100V，通电50min.　　3、染色漂洗　　电泳完毕后，将薄膜侵泡在染色液中5min～10min.取出，用漂洗液漂至背景无色　　4、定量　　取出六只试管，将漂净的薄膜用滤纸吸干，剪下薄膜上各条蛋白质色带，另取一条与各区带相近似宽的无蛋白质附着的空白薄膜，分别侵泡于/LNaOH溶液中，然后用7200型分光光度计在650nm处比色，以空白条薄膜洗出液为空白调零，测定各管的吸光度　　(五)实验数据记录：　　AA?A?AA?2?1白设各部分吸光率为、、、、　　A总＝A白＋A?1＋A?2＋A?＋A?　　A总＝　　A白A总＝;?1球蛋白比率＝A?1A总＝白蛋白比率＝　　?2球蛋白比率＝A?2A总＝;?球蛋白比率＝A?A总＝　　A?球蛋白比率＝?A总＝　　(六)实验讨论：　　1.以血清为样品，和滤纸相比，用醋酸纤维薄膜电泳的优点是用时少，效果较明显2.为什么用pH为的巴比妥缓冲溶液来侵泡醋酸纤维薄膜，是因为人体正常血液的pH值为7..35～，血清蛋白在碱性条件下带负电荷，在直流电场中向正极流动。

　　3.本次试验结果中，?球蛋白测得的含量偏低，原因可能是在剪裁电泳带时遗漏了一条薄膜没有剪下或剪裁时剪到其他蛋白质条，导致其他蛋白质含量偏高另外电泳时间较短，导致几种蛋白质分离不完全，不利于观察分析，应增大电压和增长电泳时间　　XX年9月16日　　实验五醋酸纤维素薄膜电泳法分离血清蛋白　　13生物基地XX刘洋XX-04-29　　同组者：张奕　　一、实验目的　　掌握醋酸纤维素薄膜电泳法分离血清蛋白的原理和方法　　二、实验原理　　蛋白质是两性电解质在pH值小于其等电点的溶液中，蛋白质为正离子，在电场中向阴极移动；在pH值大于其等电点的溶液中，蛋白质为负离子，在电场中向阳极移动血清中含有数种蛋白质，它们所具有的可解离基团不同，在同一pH的溶液中，所带净电荷不同，故可利用电泳法将它们分离　　血清中含有清蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白等，各种蛋白质由于氨基酸祖坟、立体构象、相对分子质量、等电点及形状不同，在电场中迁移速度不同由表可知，血清中5种蛋白质的等电点大部分低于pH值，所以在的缓冲液中，它们都电离成　　在一定范围内，蛋白质的含量与结合的燃染料量成正比，故可将蛋白质区带剪下，分别用/LNaOH溶液浸洗下来，进行比色，测定其相对含量。

也可以将染色后的薄膜直接用光密度计扫描，测定其相对含量　　肾病、弥漫性肝损害、肝硬化、原发性肝癌、多发性骨髓瘤、慢性炎症、妊娠等都可以使白蛋白下降肾病时α1、α2、β球蛋白升高，γ-球蛋白降低肝硬化时α2、β-球蛋白降低，而α1、γ-球蛋白升高　　三、实验器材　　1.醋酸纤维薄膜2.人血清；　　3.烧杯及培养皿数只；4.点样器；5.镊子；6.玻璃棒；　　7.电吹风；8.恒温水浴锅；9.电泳槽；　　10.直流稳压电泳仪；11.剪刀　　四、实验试剂　　1.巴比妥-巴比妥钠缓冲液　　2.染色液3.漂洗液：95%乙醇45ml，冰醋酸5ml，水50ml4.透明液：无水乙醇14ml，冰醋酸6ml5.健康人血清　　五、实验步骤　　1.薄膜浸泡：　　提前将醋酸纤维薄膜浸泡30min以上；2.电泳仪检查：　　水平检查，电源检查；3.电泳槽的准备：　　在两个电极槽中，各倒入等体积的电极缓冲液将滤纸条对折，翻过来，用电极缓冲液完全浸湿，架在电泳槽的四个膜支架上，使滤纸一端的长边与支架前沿对齐，另一端浸入电极缓冲液内用玻璃棒轻轻挤压在膜支架上的滤纸以驱逐气泡，使滤纸的一端能紧贴在膜支架上滤纸条是两个电极槽联系醋酸纤维素薄膜的桥梁，故称为滤纸桥。

　　4.点样：　　取新鲜血清于载玻片上，将盖玻片掰呈适宜大小，使一边小于薄膜宽度把浸泡好的可用的醋酸纤维素薄膜取出，用滤纸吸去表面多余的液体，然后平铺在滤纸上，将盖玻片在血清中轻轻划一下，再在膜条一端~2cm处轻轻地水平落下并迅速提起，即在膜条上点上了细条状的血清样品，呈淡黄色　　5.电泳：　　用镊子将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸桥上(点样面朝下)、另一端平贴在阳极端支架上,用镊子将其中气泡赶出要求薄膜紧贴滤纸桥并绷直，中间不能下垂盖上电泳槽盖接好电路，调节电压到90V，预电泳10min，再调电压至110V，电泳时间50min～1h6.染色：　　将。