大鼠海马可塑性改变对谷氨酸受体通道及其相关突触蛋白表达调控的研究.pdf

浙江大学博士学位论文序学习记忆的神经生物学基础是神经细胞之间的联系结构突触的可塑性变化，大脑边缘系统海马结构作为学习记忆的关键部位，是一个具有可塑性的脑区海马可塑性包括结构的及功能的可塑性，其中结构可塑性是功能可塑性的基础已经证明，某种突触的活动可以导致突触能量上长效的变化，这种使突触发生长效的功能增强现象称为长时程增强( L 1 、P ) I 胛·是突触可塑性的一种形式，也是表现可塑性的一个重要的电生理指标这种突触传递伴随了离子通道的效能改变，即发生了神经电生理活动的改变在神经化学物质活动方面的改变主要包括相应受体的数量、亲和力的变化、相应受体和不同蛋白质问的相互作用以及突触后神经元内信号转导的变化，这些都参与对离子通道功能的调节可塑性研究已经被越来越广泛地应用于与脑功能变化相关的研究，如帕金森病、阿尔茨海默病、药物成瘾等，并被认为是学习以及多种脑功能疾病导致的行为适应性的神经机制和神经生物学基础加州大学伯克利分校的蒲慕明教授所带领的研究小组发现，中脑腹侧被盖区多巴胺神经元的突触可塑性的改变是由滥用药物导致的神经回路的持久的修饰作用之一但是这一论点也不足以完全解释成瘾和戒断近年来的研究表明，药物成瘾和学习记忆都依赖于某些共同的神经生物学机制，从而使药物成瘾被纳入了学习与记忆的研究范畴，称其为成瘾记忆，并且属于长时记忆的范畴。

因此，已经有人提出慢性应用阿片类物质可以明显影响海马的可塑性，从而导致耐受依赖的形成在本学位论文的第一章节，我们主要阐明了由一种简单的、经典的高频刺激的方法引起的海马可塑性在神经电生理活动和神经化学物质活动这两个层面的变化；而在论文的第二章节，我们将在一种涉及更复杂的突触活性改变的动物模型，吗啡成瘾和戒断模型上，继续探讨特定活性调节的海马可塑性的变化浙江大学博士学位论文中文摘要长时程增强( 1 0 n g ．t e mp o t e n t i a t i o n ，L T P ) 是一种由简单的高频刺激兴奋性输入端引起的突触强度的持续性增强，在大鼠海马，来自C A 3 区锥体细胞的s c h a 虢r 侧枝与c A l 区锥体细胞树突形成突触，刺激s c h a 氐r 侧枝使c A l 区锥体细胞任何树突层受刺激均可诱出L T P 常用兴奋性突触后场电位( 玎弹S P ) 来判定突触传递是否强化以及是否出现L 丁P 作为神经科学研究当中衡量突触可塑性的一个主要的电生理指标，是研究得最为广泛的活性依赖的突触可塑性的细胞水平的模型，也是研究学习记忆的细胞水平的模型，它反映了突触可塑性变化中的神经电生理活动方面的改变。

现在认为，药物依赖和学习记忆之间存在着某种共同的分子机制，即参与正常学习记忆的机制也可能参与了成瘾形成和发展海马作为脑内主要的学习器官，其c A l 区的神经元作为海马信息输出的最主要和最直接的贡献者，可以通过下托投射到其它包括奖励中枢和前额叶等许多脑区在成瘾和戒断过程中，也可能发生了海马可塑性的改变谷氨酸受体是海马内主要的兴奋性神经递质受体，兴奋性突触释放的谷氨酸主要与两种突触后离子型谷氨酸受体结合，它们是N M D A 受体和A M P A 受体重组受体药理学和m R N A 原位杂交研究提示N M D A 受体可能有多种亚型，亚单位的不同组合方式和多样性是决定N M D A 受体亚型多样性的重要基础A M P A受体具有四个亚单位，为G 1 u R l 4 ，在海马组织，舢胛A 受体的亚型主要为G l u R l ／2 和G l l I R 2 ／3 ，但在各核团，亚单位的分布也有差异一般认为，N M D A受体在大多数通路中对诱导L T P 是必需的，而A M P A 受体则主要决定了L T P的表达和维持神经元通过调节兴奋性突触后膜A M P A 受体的数量和亚单位组成，可以改变兴奋性突触的活性和传递效能，因此，A M P A 受体的膜转运也被认为是突触可塑性调节的重要环节。

在突触上，N M D A 受体以多蛋白复合物形式存在并起作用的，其中包括神经递质受体、细胞黏附蛋白、细胞骨架蛋白、支架蛋白、信号分子等，这种N M D A 受体与多种信号通路在同一复合物中的共存是N M D A 受体在突触可塑性、学习记忆中起重要作用的结构基础受体在突触上3浙江人学博士学位论立的数目、种类、组成、与不同蛋白间的相互作用以及下游的信号传导通路的改变都组成了神经化学物质活动的改变，从而参与了突触可塑性的改变为了更好的从神经电生理活动改变以及神经化学物质活动改变这两个方面去理解活性依赖的突触可塑性的改变，我们的研究主要围绕大鼠海马可塑性改变对谷氨酸受体通道及其相关突触蛋白的表达调控而展开：一、我们用简单的、经典的高频刺激诱导海马突触活性的改变，然后观察突触后电生理活动的改变以及伴随着的重要的突触蛋白的改变；二、我在一种独特的、尤其复杂的、经验依赖的突触活性改变的动物模型，戒断模型上继续探讨海马突触可塑性的变化结果1 ．我们在整体大鼠的海马s c h 般r 侧枝旁路，用经典的高频刺激的方法来诱导长时程增强，在海马C A l 区我们记录兴奋性突触后场电位( 也P s P ) ，并通过N I 也B 亚型受体特异性拮抗剂R 0 2 5 —6 9 8 1 、竞争性N M D A 受体拮抗剂A _ P ．5 和N M D A 受体通道阻断剂M K - 8 0 1 。

我们第一次在整体动物水平上证明成年大鼠海马C A l 区建立的N M D A 受体介导的L T P 是不依赖于N I 匕B 亚单位的活性2 ．为了阐明L T P 诱导之后带来的突触上相关分子的改变，我们采用免疫印迹方法检测了经强直刺激诱导L T P 后的海马组织中的谷氨酸受体及其相关的蛋白的表达改变已有的文献表明，用密度梯度离心方法制备的突触小体可以被看作是突触蛋白的亚细胞组分，所以我们采用经典的蔗糖密度梯度离心手段来制备突触小体，然后用半定量免疫印迹方法来检测突触小体组分中相关蛋白的表达水平，以此阐明相关蛋白在突触上的量的变化另外我们检测海马组织匀浆中的蛋白表达水平，来代表相关蛋白在海马组织的总的表达量研究结果显示，经刺激的海马中制备突触小体的谷氨酸受体的亚单位Q 取1 ，N R 2 A ，N R 2 B ，G l u R l ，G 1 u R 2 ，3 ) ，与受体在突触定位和表达密切相关的支架蛋白( S A P 9 7 ，P S D 9 5 ) ，对受体突触表达和定位以及L T P 的维持起调节作用的分子( I 】N o s ，N s F ) ，信号分子( C a M ⅪI Ⅱ) 在L T P 诱导后1 8 0 分钟都表现出不同程度的表达上调，而在L T P 诱导后3 0 分钟，表达改变并不明显。

同时，我们还发现在突触小体组分里，C 心4 K l I Ⅱ在苏氨酸2 8 6 位点的自磷酸化水平以及G l u R l 在丝氨酸8 3 l 位点的磷酸化水平在L T P 诱导后3 0 分钟的增加幅度明显高于诱导后1 8 0 分钟并且，这种蛋白水d浙江大学博上学位论文平和磷酸化修饰水平的上调都是u ’P 依赖的，因为用A P 一5 和M K - 8 0 1 阻断L 1 1 P后就不再观察到这种上调在假手术组( 即在O ．0 3 3 H z 下基线记录4 0 分钟) 和空白对照组( 不经过刺激和其它任何处理) 中，突触小体组分里这些蛋白的表达和磷酸化修饰都维持在基础状态水平3 ．在海马组织的匀浆中，我们没有观察到这些蛋白表达的改变，仅观察到C a M ⅪI 旺在苏氨酸2 8 6 位点的自磷酸化水平以及G l u R l 在丝氨酸8 3 l 位点的磷酸化水平在u ，诱导后3 0 分钟有一定程度的增加而我们检测的其它几个突触蛋白( N R 2 B ，o l l 肥／3 ，N s F ) 在突触组分里含量变化并不受L T P 诱导的影响，表明L T P 依赖的相关蛋白表达的改变是选择性的我们并观察到R 0 2 5 —6 9 8 l 处理下L T P 诱导后3 0 分钟和1 8 0 分钟蛋白表达水平和磷酸化水平，结果发现除了c a M ⅪI Ⅱ总蛋白水平改变不明显外其他改变与正常L T P 相似，提示N R 2 B 亚型 受体的抑制可能干扰了C 心衄0 【在突触上的定位。

4 ．我们对成年的大鼠进行为期1 2 天的慢性吗啡处理，该方法已经被国际上多个研究小组报道能够引起动物的成瘾，即对吗啡产生依赖；然后分别戒断2 小时，1 8 小时，4 天，7 天和2 0 天在成瘾结束以及戒断的这几个时间点上我们进行了突触可塑性的研究以及突触上蛋白( N M D A 受体亚单位N R 2 A 、N R 2 B ， 舢Ⅲ慷受体亚单位G l u R l 、G l u R 2 ／3 ，C a M Ⅺk ，p T 2 8 6 ．C 蝴m ) 表达状况的研究我们发现，在戒断过程中，海马的突触可塑性发生了明显的改变，主要表现为长时程增强诱导的程度增强和阈值下降，也就是说戒断的动物更容易被诱导出稳定持续的长时程增强：在第四天的时候，我们用2 0 0H z 的高频刺激在海马c A l区记录到的兴奋性突触后场电位比其它几个戒断的时间点大既然N R 2 A 和N R 2 B 的比值可能影响了突触可塑性的趋向，我们用免疫印迹的方法比较了戒断过程几个不同时间点上，海马的亚细胞组分( 质膜和突触小体) 里的N R 2 A 和N R 2 B 的相对量的变化经研究发现，N R 2 B 在突触上的表达在残断四天的时候最低，而N R 2 A 的突触定位在戒断过程中一直都保持在低于对照组的水平；但是我们可以看出在戒断四天的时候，N I 匕A 和N R 2 B 的比值比其它几个时间点高出很多，因此突触上含N R 2 A 亚单位的N M D A 受体亚型和含N R 2 B 亚单位的N M D A 受体亚型的相对含量可能参与了戒断过程中突触可塑性在L T P 程度和趋向方面的改变。

气浙江大学博士学位论文5 ．在本研究中，通过比较成瘾和戒断过程中，海马亚细胞组分细胞质膜和突触小体之间创讧P A 受体亚单位及其相关信号分子的蛋白水平，我们可以推测这些被检测的蛋白到突触上的插入以及从突触上的撤离，我们的结果也提示在突触外，可能存在蛋白的储存库我们的研究发现，重复吗啡暴露能够显著增加海马突触上G 1 u R l 、G l u R 2 ／3 和p C a M 融I a 的定位在戒断的所有检测的几个时间中，海马突触上C 棚：I I d 轻微下调，而其苏氨酸磷酸化先减少而后又逐渐恢复到成瘾组的水平，而成瘾动物的p C a M 脚I 晓明显高于生理盐水对照组戒断过程中观察到的C a M ⅪI 值以及p C a M K ⅡⅡ在海马突触上的表达变化可能调节了戒断过程中A l v i I 狐受体在突触上的定位6 ．海马是应激的一个很重要的靶部位，戒断过程中的应激可能会导致药物渴求和复发应激条件下释放的糖皮质激素可以和海马内广泛分布的糖皮质激素受体结合在我们的实验研究中，高台应激大大减少了G 】u R 2 ／3 在突触上的表达，而对G I u R l 的下调作用是轻微的；而且戒断四天时候G 1 u R 2 ，3 在两种亚细胞组分里表达的增加可以被糖皮质激素受体拮抗剂R u 3 8 4 8 6 抑制。

既然N M D A 受体的活动对大鼠海马可塑性有重要的调控作用，不仅如此，N M D A 受体的活性在阿片类药物的耐受和依赖中也起重要作用，因此我们在戒断过程中给予竞争性N M D A 受体拮抗剂A P - 5 或N M D A 受体亚单位N R 2 B 特异性的抑制剂R 0 2 5 —6 9 8 1 ，以观察对m 4 D A 受体活性的抑制是否会影响戒断导致的A M P A 受体亚单位及其相关信号分子在两种亚细胞组分里的蛋白水平的变化我们发现，在戒断过程中给予A P ．5 或R 0 2 5 ．6 9 8 1 ，两者带来的分子的改变是类似的，都导致了两种。