食品理化分析第五章食品中毒素物质的检测.ppt

第五章食品中毒素物质的检测,第一节 食品中霉菌毒素及其检测 一、霉菌毒素的种类 霉菌是一些丝状真菌的通称，在自然界分布很广,几乎无处不有，主要生长在不通风、阴暗、潮湿和温度较高的环境中霉菌可非常容易地生长在各种食品上并产生危害性很强的霉菌毒素目前已知的霉菌毒素约有200余种，与食品关系较为密切的有黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、杂色曲霉素等已知有5种毒素可引起动物致癌，它们是黄曲霉毒素、黄天精、环氯素、杂色曲霉素和展青霉素霉菌污染食品可使食品的食用价值降低，甚至使之完全不能食用，造成巨大的经济损失据统计全世界每年平均有2％的谷物由于霉变不能食用霉菌毒素引起的中毒大多通过被霉菌污染的粮食、油料作物以及发酵食品等引起 霉菌毒素多数有较强的耐热性，一般的烹调加热方法不能使其破坏当人体摄入的霉菌毒素量达到一定程度后，可引起中毒霉菌中毒往往表现为明显的地方性和季节性，临床表现较为复杂，有急性中毒、慢性中毒以及致癌、致畸和致突变等食品中常见的几类霉菌毒素如下:,1.黄曲霉毒素,黄曲霉毒素(Aflatoxins简写AFT)是黄曲霉、寄生曲霉及温特曲霉等产毒菌株的代谢产物,黄曲霉毒素是一组化学结构类似的化合物，目前已分离鉴定出12种，包括B1、B2、Gl、G2、Ml、M2、Pl、Q、H1、GM、B2a和毒醇。

根据其在波长为365nm紫外光下呈现不同颜色的荧光而分为B、G二大类： B大类在氧化铝薄层板上于紫外光照射下呈现蓝色荧光；G大类则呈绿色荧光AFT主要污染粮油及其制品，如花生、花生油、玉米、大米、棉籽、胡桃、杏仁、高梁、小麦、豆类、王豆等被污染严重，此外各种植物性与动物性食品也能被广泛污染，如在皮蛋、奶与奶制品、干咸鱼及辣椒中均有AFT污染其污染程度与各种作物生物学特性和化学组成以及成熟期所处的气候条件有很大关系一般来说，富含脂肪的粮食易产生AFT此外，收获季节高温、高湿，也易造成AFT的污染AFT是剧毒物质，其毒性比氰化钾还高，也是目前最强的化学致癌物质其中AFT Bl的毒性和致癌性最强，故其在食品中允许量各国都有严格规定 FAO／WHO规定食品中 AFT Bl ＜15 ppb， 美国≤20 ppb， 日本≤10 ppb， 以色列与瑞典规定不得检出黄曲霉毒素的基本结构为二呋喃环和香豆素，B1是二氢呋喃氧杂萘邻酮的衍生物即含有一个双呋喃环和一个氧杂萘邻酮(香豆素)前者为基本毒性结构，呋喃环末端有双键的毒性最大如B1 、G1 、M1，后者与致癌有关M1是黄曲霉毒素B1在体内经过羟化而衍生成的代谢产物。

黄曲霉毒素的主要分子型式含B1、B2、G1、G2、M1、M2等其中M1和M2主要存在于牛奶中黄曲霉毒素的结构与理化性质 (一)黄曲霉毒素的结构,,(二)黄曲霉毒素的理化性质 1.溶解性：AFT的分子量为312-346，难溶于水、乙醚、石油醚及己烷中，易溶于油和甲醇、丙酮、氯仿、苯等有机溶剂中 2.稳定性：AFT是一组性质比较稳定的化合物；其对光、热、酸较稳定，而对碱和氧化剂则不稳定2.赭曲霉毒素 赭曲霉毒素是分子结构类似的一组化合物，包括赭曲霉毒素A、B、C、D和α，是曲霉属和青霉属的某些菌种的次生代谢产物，是谷物、大豆、咖啡豆和可可豆的常见污染物，其中赭曲霉毒素A是该类毒素的代表化合物赭曲霉毒素A微溶于水，易溶于极性溶剂和稀的碳酸氢钠水溶液，耐热，稳定性强，在紫外光下呈绿色荧光赭曲霉毒素A的毒性较强，接近黄曲霉毒素B1，主要损伤肾脏在巴尔干地方性肾病流行地区，6％～18％人群的血液中能检出赭曲霉毒素A1993年国家癌症研究机构认为赭曲霉毒素A同时也是一种具有免疫抑制功能、神经毒性以及致癌、致畸形的物质3.展青霉毒素 展青霉毒素是多种真菌的有毒代谢物，该物质一方面是一种广谱的抗生素，另一方面对小鼠、兔子等试验动物具有较强的毒性。

其污染食品和饲料后产生的毒性远大于其抗菌作用 容易污染食品和饲料并产生展青霉素的真菌主要有柯麻青霉、扩展青霉、棒曲霉、巨大曲霉、雪白丝衣霉等展青霉素还能够对苹果及其制品造成严重污染展青霉素对大鼠的肾及胃肠系统有毒性作用，也有致癌、致畸形的作用目前，已有十几个国家制定了水果及其制品中展青霉素的限量标准4．单端孢霉烯族化合物 该组化合物的主要毒性表现在细胞毒性、免疫抑制和致畸、致癌作用关于单端孢霉烯族化合物造成的食物中毒在国内外已有多起报道，主要症状是头痛、恶心、呕吐、腹痛、腹泻等5．玉米赤霉烯酮 玉米赤霉烯酮也称F-2毒素镰刀菌属的多个菌种如禾谷镰刀菌、三线镰刀菌、粉红镰刀菌、半裸镰刀菌、木贼镰刀菌、黄色镰刀茵、茄病镰刀菌、串珠镰刀菌等都可以产生该毒素这些菌广泛存在于土壤、空气及污染的谷物中，主要污染玉米，也污染大麦、小麦、燕麦等玉米的阳性检出率可达45％，最高含毒量可达2909 mg／g, 小麦的阳性检出率可达20％，含毒量为0.36～11.05 mg／kg玉米赤霉烯酮对动物的急性毒性很小该化合物具有雌激素样的作用，主要作用于生殖系统，可引起阴道和乳腺肿胀、流产、畸胎、死胎等对玉米赤霉烯酮的最高限量很多国家已制定了标准，如巴西规定玉米中不超过200 ug／kg，罗马尼亚规定所有食品中不超过30 ug/kg，我国尚未制定限量。

6.杂色曲霉素 杂色曲霉素主要是由杂色曲霉、构巢曲霉、皱褶曲霉、黄褐曲霉、四脊曲霉等产生，主要污染玉米、大米、小麦、花生等杂色曲霉素与黄曲霉素B1相似 杂色曲霉素可以转换为黄曲霉素B1 杂色曲霉素是一种毒性很强的肝及肾脏毒素肝癌高发区居民所食用的食物中杂色曲霉素的污染也较为严重7.棒曲霉素 8.岛青霉毒素 9.其他霉菌毒素 串珠镰刀菌毒素、伏马菌素(主要是FBl)这两种毒素都可由串珠镰刀菌产生，两者皆为水溶性化合物，都有强烈的毒性二、霉菌毒素的检测(以黄曲霉毒素为例),AFT属剧毒物质，其毒性比氰化钾还高，是目前发现的最强的化学致癌物质，其中以AFTB1的毒性和致癌性最强在一般情况下如未检查出AFTB1，就不存在其它的AFT，所以食品安全检测中主要以AFTB1为主要指标黄曲霉毒素的检测方法主要有薄层色谱法，高效液相色谱法，酶联免疫法、荧光光度法、微柱筛选法等一)薄层色谱法测定食品中黄曲霉毒素B1 GB/T5009.22-2003第一法,薄层色谱法是在黄曲霉毒素研究方面应用较广的分离技术，自1990年，它被列AOAC(association of official agricultural chemists)标准方法，也是我国AFT标准分析方法中的第一法。

薄层色谱法同时具有定性和定量分析黄曲霉毒素的功能，多年来广泛用于黄曲霉毒素的分析,属于半定量分析，其最低检出量0.4ng是各实验室所公认的1、原理 样品中的黄曲霉毒素B1，经有机溶剂提取、净化、浓缩、薄层分离后，在波长365nm紫外光下产生蓝紫色荧光，根据其在薄层上显示荧光的最低检出量来测定黄曲霉毒素B1的含量 薄层色谱法测定黄曲霉毒素B1的最低检出量为0.0004ug，最低检出浓度为5ug／Kg2、仪器和试剂 (1)仪器 小型粉碎机、样筛、电动振荡器、玻璃浓缩器、玻璃板5cm×20cm、薄层板涂布器、展开槽(25cm×6cm×4cm)、紫外光灯100一125w、波长365nm滤光片、微量注射器 (2)试剂 ①三氯甲烷、正己烷(沸程30～60℃)或石油醚(沸程60～90℃)、甲醇、苯、乙腈、无水乙醚或乙醚经无水硫酸钠脱水、丙酮以上试剂在试验前需先进行空白试验，如不干扰测定即可使用，否则需逐一进行重蒸②硅胶G(薄层色谱用)、三氟乙酸、无水硫酸钠、氯化钠、苯一乙腈(98+2)混合液、甲醇水溶液(55+45) ③黄曲霉毒素B1标准液：准确称取1-1.2mg AFTB1标准品，先加入2mL乙腈溶解后，再用苯稀释至100mL，避光、于冰箱4℃保存。

此标准液浓度约为10ug／mL先用紫外分光光度计测定其浓度，再用苯一乙腈混合液调整其浓度为准确10.0ug／mL在350nm，AFTB1在苯一乙腈(98+2)混合液中的摩尔消光系数为19800 .,④黄曲霉毒素B1标准使用液： Ⅰ液(1.0ug/mL)：取1mLAFTB1标准液(10.0ug／mL) 于10mL容量瓶中,用苯一乙腈混 合液稀释、定容 Ⅱ液(0.2ug/mL)：取I液1mL，按上法定容5mL Ⅲ液(0.04ug/mL)：取Ⅱ液1mL，按上法定容5mI ⑤次氯酸钠溶液(消毒用)：取100g漂白粉，加入500mL水，搅拌均匀另将80g工业用碳酸钠(Na2CO3·H2O)溶于500mL温水中将两液合并、搅拌、澄清、过滤此液含次氯酸25g／L污染的玻璃器皿用次氯酸钠溶液浸泡可达到去毒的效果3、操作步骤 (1)样品处理 (2)提取 称取20.00g经粉碎样品，置于250mL具塞锥形瓶中，加30mL正己烷或石油醚和100mL甲醇水清液，瓶塞上涂一层水、盖严防漏振荡30min，静置片刻，以叠成折叠式的快速定性滤纸过滤于分液漏斗中，待下层甲醇水溶液分清后，放出甲醇水溶液于另一具塞锥形瓶内。

取20.00mL甲醇水溶液置于另一分液漏斗中，加20mL三氯甲烷，振摇2min、静置分层放出三氯甲烷层，经盛有约10g预先用三氯甲烷湿润的无水硫酸钠的定量慢速滤纸，过滤于50mL蒸发皿中，三氯甲烷重复振摇提取，三氯甲烷层一并滤于蒸发皿中，最后用少量三氯甲烷洗过滤器，洗液并于蒸发皿中将蒸发皿放在通风柜，于65℃水浴上通风挥干，然后于冰盒上冷却2～3min后，准确加入1mL苯一乙腈混合液用带橡皮头的滴管的管尖将残渣充分混合，转移于2mL的具塞试管中3)测定 ①单向展开法 a.薄板制备：称取3g硅胶G，加2～3倍量的水，研磨呈糊状后，厚度约0.25mm的薄层板在空气中干燥15min，在100℃活化2h，取出，干燥器中保存一般可保存2～3d，若放置时间较长，可再活化后使用 b.点样：将薄板边缘附着的吸附剂刮净，在距薄层板下端1cm的基线上滴加样液一块板可滴加4个点，点距边缘和点间距为lcm，点直径约1mm，在同一板上滴加点的大小应一致，滴加时可用吹风机用冷风边吸边加滴加样式如下：,第一点：10μL AFTB1标准使用液(0.04μg／mL) 第二点：20μL样液 第三点：20μL样液+10μL 0.04μg／mL AFTBl标准使用液。

第四点：20μL样液+10μL 0.2μg／mL AFTB1标准使用液 c.展开与观察 在展开槽内加10mL无水乙醚，预展12cm，取出挥干再于另一展开槽内加10mL丙酮一三氯甲烷(8+92)，展开10～12cm，取出，在紫外光下观察结果，方法如下：,Ⅰ.由于样液上加滴了AFTB1标准，可使AFTB1标准点与样液中AFTB1荧光点重叠若样液为阴性，薄板上第三点AFTB1为0.0004μg，可用作检查样液中AFTB1最低检出量是否正常出现；若样液为阳性；则起定性作用薄层板上第四点AFTB1标准为0.002ug．主要起定位作用 Ⅱ.若第二点与AFTB1标准点的相应位置上无蓝色荧光点，则表示样品中AFTBl含量5ug／kg；若在相应位置上有蓝色荧光点，则须进行确证试验d.确证试验 为确认薄层样上样液荧光系由黄曲霉毒素B1产生的，加滴三氟乙酸，产生AFTB1的衍生物，展开后此衍生物的比移值在0.1左右于薄层板左边依次滴加两个点 第一点：10uL 0.04ug／mLAFTBl标准使用液 第二点：20μL样液 于以上两点各加一小滴三氟乙酸盖 于其上，反应5min后，用吹风机吹热风2min(板上温度不高于40℃)，再于薄层板上滴加以下两点。

第三点：10uL 0.04ug／mLAFTBl标准使用液 第四点：20μL样液按上法展开并观察，样液是否产生与AFTB1标准点相同的衍生物未加三氟乙酸的三、四两点，可依次作为标准与标准的衍生物空白对照 e.稀释定量。