基因表达分析技术课件.ppt

基因表达分析技术基因表达分析技术METHODS FOR ANALYZING GENE EXPRESSION基因表达分析技术基因mRNAmRNA蛋白质多肽链蛋白质多肽链基因表达基因mRNA蛋白质多肽链基因表达一、通过检测一、通过检测mRNA揭示基因转录水平的表达特征揭示基因转录水平的表达特征根据分析方法的原理和功能特性，可将基因表达分析分根据分析方法的原理和功能特性，可将基因表达分析分为:封封闭性系性系统研究方法研究方法: 例如例如DNA微微阵列、列、Northern印迹、印迹、实时RT-PCR等方法只能研究已知的基因只能研究已知的基因开放性系开放性系统研究方法研究方法: 如差异如差异显示示PCR、双向基因表达指、双向基因表达指纹图谱、分子索引法、随机引物、分子索引法、随机引物PCR指指纹分析等，可以分析等，可以发现和分析未知的基因和分析未知的基因这里主要里主要针对已知基因的常用表达分析方法做一介已知基因的常用表达分析方法做一介绍一、通过检测mRNA根据分析方法的原理和功能特性，可将基因表（一）基于杂交原理检测（一）基于杂交原理检测mRNAmRNA的表达水平的表达水平1．．Northern 印迹印迹（（Northern blot））※※是一种基于是一种基于RNA-DNA杂交原理建立的一种交原理建立的一种RNA分析技分析技术※※指将指将RNA变性及性及电泳分离后，并泳分离后，并转移到固相支持物上，用移到固相支持物上，用杂交反交反应来来鉴定其中特定定其中特定mRNA分子的含量及其大小。

分子的含量及其大小一）基于杂交原理检测mRNA的表达水平1．Northern三种印迹技三种印迹技术的比的比较三种印迹技术的比较RNA琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳3kb0.4 kbNt36382604623Northern blot hybridization28S18SRNA琼脂糖凝胶电泳3kbNtNorthern blot h分子分子杂交交实验分子杂交实验放放射射自自显影影照照片片目目 录录放射自显影照片目 录2．核糖核酸．核糖核酸酶保保护实验（（ribonuclease protection assay，，RPA））Ø是灵敏度和特异性很高的是灵敏度和特异性很高的mRNA定量分析方法定量分析方法 Ø基本原理基本原理 是是将将标记的的特特异异RNA探探针（（32P或或生生物物素素））与与待待测的的RNA样品品液液相相杂交交，，标记的的特特异异RNA探探针与与目目的的RNA结合合，，形形成成双双链RNA，，免免受受RNA酶的的消消化化；；而而未未结合合的的单链RNA经RNA酶A或或RNA酶T1消消化化形成寡核糖核酸形成寡核糖核酸2．核糖核酸酶保护实验RPA基本程序：基本程序：●待测待测RNARNA的分离的分离●体外转录标记体外转录标记RNARNA探针探针●待测待测RNARNA与探针与探针RNARNA进行液相杂交进行液相杂交● RNA酶消化酶消化●不同大小杂交片段凝胶电泳分离不同大小杂交片段凝胶电泳分离RPA基本程序：●待测RNA的分离核糖核酸酶保护实验原理示意图核糖核酸酶保护实验原理示意图32P标记的探针：杂交双链进行变性PAGE， 用放射自显影或磷屏成像系统检测探针的信号；生物素标记的探针：杂交双链经过变性PAGE后，电转移至尼龙膜，用链霉亲和素－辣根过氧化物酶和化学发光底物与膜上biotin标记的探针结合，X射线胶片或化学发光图像分析仪检测杂交信号。

核糖核酸酶保护实验原理示意图32P标记的探针：杂交双链进行变RPA比比Northern Blot的优势：的优势：•1.过量的探针与目的基因的杂交在液相环境完成，反应更过量的探针与目的基因的杂交在液相环境完成，反应更加完全加完全 •2.RPA比比Northern Blot灵敏灵敏15－－150倍，适合检测各种表达倍，适合检测各种表达水平之基因水平之基因 •3.RPA通量高，同时检测多个基因，可评价他们在同一情通量高，同时检测多个基因，可评价他们在同一情况下的差异表达况下的差异表达 •4.一次一次RPA就能完成就能完成10 多次多次Northern Blot的工作，加快研的工作，加快研究速度究速度RPA比Northern Blot的优势：Ø可可细胞或胞或组织中原位表达的中原位表达的mRNA进行区域定位行区域定位Ø标记探探针特特异异性性地地与与目目标靶靶mRNA序序列列杂交交，，检测标记信号来确定基因在信号来确定基因在组织和和细胞内表达的区位信息胞内表达的区位信息Ø可作可作为定量分析的定量分析的补充3．原位．原位杂交（交（in situ hybridization，，ISH））可细胞或组织中原位表达的mRNA进行区域定位3．原位杂交（i原位杂交技术主要步骤：原位杂交技术主要步骤：•材料处理及细胞样品的固定；材料处理及细胞样品的固定；•样品的制备和预处理；样品的制备和预处理；•探针的制备和预杂交；探针的制备和预杂交；•探针及样品的变性；探针及样品的变性；•杂交温育；杂交温育；•检测杂交信号，进行结果分析。

检测杂交信号，进行结果分析原位杂交技术主要步骤：材料处理及细胞样品的固定；（二）（二）RT-PCR常用的常用的mRNA检测方法检测方法1．反．反转录PCRØ可用于可用于mRNA的半定量分析的半定量分析 Ø反反转录PCR（（reverse transcription-PCR，，RT-PCR）） 它它以以mRNA为模模板板，，体体外外扩增增cDNA，，再再以以cDNA为模模板板进行行特特定定基基因因转录产物物的的PCR扩增增RT-PCR技技术一一般般用用于于RNA的的定定性性分分析析；；如如果果设置置阳阳性性参参照照，，则可可对待待测RNA样品品进行半定量分析行半定量分析Ø反反转录实时定量定量PCR （二）RT-PCR常用的mRNA检测方法1．反转录PCR逆转录酶ＤＮＡ聚合酶mRNAmRNAcDNAcDNA杂化双链杂化双链PCR扩增逆转录酶ＤＮＡ聚合酶mRNAcDNA杂化双链PCR扩增PCRPCR技术原理技术原理技术原理技术原理PCR技术原理5 Primer 15  Primer 2Cycle 2Cycle 15 5  5 5  5  5 Template DNA5 5  5 5 5  5  5 5 一、基本工作原理一、基本工作原理目目 录录5Primer 15Primer 2Cycle 2CycCycle 35 5  5 5 5  5  5 5 5  5  5 5  5 5 5  5 25～～30 次循次循环后，模板后，模板DNA的含量的含量可以可以扩大大100万倍以上。

万倍以上目目 录录Cycle 355 555 5 555 5n模板模板DNAn 特异性引物特异性引物n耐耐热DNA聚合聚合酶n dNTPsn Mg2+ PCRPCR体系基本组成成分体系基本组成成分模板DNAPCR体系基本组成成分PCR的基本反应步骤的基本反应步骤变性性95˚C延伸延伸72˚C退火退火Tm-5˚CPCR的基本反应步骤变性延伸退火实验仪器实验仪器电泳仪电泳仪实验仪器电泳仪琼脂糖凝胶电泳槽琼脂糖凝胶电泳槽琼脂糖凝胶电泳槽琼脂糖凝胶电泳槽琼脂糖凝胶电泳槽PCR仪仪PCR仪PCR反应•PCR反应条件•PCR过程•PCR的特点PCR反应PCR反应条件实验结果实验结果PCR结果1、对照(无模板)；2－6、PCR产物（5ul样品）实验结果PCR结果1、对照(无模板)；2－6、PCR产物（凝胶成像系统凝胶成像系统凝胶成像系统凝胶成像系统凝胶成像系统Target AmplificationNo. ofNo. Amplicon CyclesCopies of Target122438416532664201,048,576301,073,741,8241 cycle = 2 Amplicon2 cycle = 4 Amplicon3 cycle = 8 Amplicon4 cycle = 16 Amplicon5 cycle = 32 Amplicon6 cycle = 64 Amplicon7 cycle = 128 AmpliconTarget AmplificationNo. ofNo.常规常规PCR方法的局限性分析：方法的局限性分析：•无法对起始模板准确定量无法对起始模板准确定量,只能对终产物进行分析只能对终产物进行分析•必须在扩增后用电泳方法分析必须在扩增后用电泳方法分析,费时费力而且费时费力而且EB有毒有毒•无法对扩增反应实时检测无法对扩增反应实时检测常规PCR方法的局限性分析：无法对起始模板准确定量,只能对终2、实时荧光定量、实时荧光定量PCR （（real-time PCR））2、实时荧光定量PCR （real-time PC非特异性的嵌入荧光染料非特异性的嵌入荧光染料 （（Non-specific DNA binding dyes））•SYBR® Green I•SYBR® Gold•Ethidium Bromide 非特异性的嵌入荧光染料 （Non-specific DNAExtension5’3’5’3’5’3’5’3’Extension ContinuedApply ExcitationWavelength5’3’5’3’5’5’TaqTaq3’5’3’TaqTaq5’5’RepeatDNA binding dyesBDBDBDBDBDBDBDBDBDBDlllllExtension5’3’5’3’5’3’5’3’Exten实时实时PCRPCR技术原理技术原理目目 录录实时PCR技术原理目 录非特异性的嵌入荧光染料评价非特异性的嵌入荧光染料评价•优点：与特异性的荧光探针相比价格便宜优点：与特异性的荧光探针相比价格便宜 只需要设计只需要设计PCR引物引物•缺点：由于它和模板的结合是非特异性缺点：由于它和模板的结合是非特异性 的，它可以和的，它可以和所有的双链所有的双链DNA包括引物和非特异性扩增产物结合，不能包括引物和非特异性扩增产物结合，不能真实反映目真实反映目 的基因的扩增情况。

的基因的扩增情况非特异性的嵌入荧光染料评价优点：与特异性的荧光探针相比价格便TaqMan探针探针 评价评价•优点：荧光信号强优点：荧光信号强 与其它探针相比设计简单与其它探针相比设计简单 可用于多通道检测可用于多通道检测 可用于可用于SNP的检测的检测•缺点：比缺点：比DNA结合染料价格高结合染料价格高TaqMan探针 评价优点：荧光信号强Ct value and Real-Time Quantitative PCR Theory•CtCt值值值值（（（（Threshold Threshold CycleCycle）））） PCR扩增过程扩增过程中，扩增产物荧中，扩增产物荧光信号超过基线光信号超过基线值（进入指数增值（进入指数增长期）时的循环长期）时的循环数Ct value and Real-Time Quantit• 模板起始浓度越高，Ct值越小• Ct值与模板起始拷贝数的对数存性关系Ct值与模板起始浓度的关系值与模板起始浓度的关系• 如果模板浓度增加1倍，Ct值就提前1个循环到达• 如果模板浓度减少1倍，Ct值就滞后1个循环到达 模板起始浓度越高，Ct值越小Ct值与模板起始浓度的关系 如绝对定量可以得到某个样本中基因的拷贝数和浓度 利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。

因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数绝对定量可以得到某个样本中基因的拷贝数和浓度 利用已知起始拷基因表达分析技术 3、原位、原位PCR技术技术基因表达分析技术原位ＰＣＲ 原位聚合酶链式反应（In Still PCR,Is－PCR）是由Haase等于1990年首创它是利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段,在不破坏细胞的前提下,利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物 直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行ＰＣＲ扩增可进行细胞内定位 适用于检测病理切片中含量较少的靶序列原位ＰＣＲ 原位聚合酶链式反应（In Still PC16块载玻片及块载玻片及24个个0.2ml管的样品管的样品block 16块载玻片及24个0.2ml管的样品block 基因表达分析技术操作步骤1. 细胞或组织固定：细胞经固定和乙醇通透化处理后便适于一般PCR试剂（包括引物和Taq酶）2. PCR扩增细胞内目的片段3. 原位杂交检测扩增产物A.阳性对照B.阴性对照C.原位检测mRNA表达操作步骤A.阳性对照B.阴性对照C.原位检测mRNA表达•DNA芯片芯片(DNA chip) •cDNA芯片芯片(cDNA chip)是指将是指将许多特定的多特定的DNA片段或片段或cDNA片片段作段作为探探针，有，有规律地律地紧密排列固定于密排列固定于单位位面面积的支持物上的支持物上 。

4、基因芯片分析基因表达谱、基因芯片分析基因表达谱（（高通量地分析基因表达高通量地分析基因表达））基因芯片基因芯片(gene chip)DNA芯片(DNA chip) 4、基因芯片分析基因表达谱基目目 录录目 录二、通过蛋白质检测揭示基因二、通过蛋白质检测揭示基因 翻译水平的表达特征翻译水平的表达特征 Western印印迹迹（（Western blot））是是一一种种免免疫疫印印迹迹技技术，，其其基基本本原原理理与与核核酸酸分分子子杂交交相相似似，，只只是是以以偶偶联标记物物的的抗抗体体分分子子作作为探探针，，检测转移移到到固固相相支支持持物物上上的的蛋蛋白白质/多多肽分分子子当当在在蛋蛋白白质水水平平上上检测特特定定基基因因的的表表达达活活性性时，，最最常常用用的的方方法法就就是是利利用用Western印印迹迹对细胞胞或或组织的的总蛋蛋白白质中的特异蛋白中的特异蛋白质进行定性和半定量分析行定性和半定量分析一）采用特异抗体经（一）采用特异抗体经Western印迹可直接印迹可直接 测定基因编码多肽测定基因编码多肽二、通过蛋白质检测揭示基因 Western印迹1.蛋白蛋白质样品的制品的制备2.SDS-PAGE分离分离3.蛋白蛋白质转膜膜4.特特异异抗抗体体（（即即第第一一抗抗体体））与与膜膜上上的的蛋蛋白白质（（抗抗原原））印印迹迹杂交交5.再再经偶偶联了了可可检测标记信信号号的的第第二二抗抗体体（（即即抗抗抗抗体体，，商品商品试剂盒中多采用偶盒中多采用偶联辣根辣根过氧化物氧化物酶的的Ig））6.最最后后经与与酶的的底底物物反反应而而显影影、、成成像像，，经扫描描后后获取取免疫印迹信息免疫印迹信息Western blot基本程序基本程序Western blot基本程序基因表达分析技术基因表达分析技术基因表达分析技术West Blot West Blot 受受检标本本+固相固相载体表面的抗原或抗体起反体表面的抗原或抗体起反应——结合特异抗合特异抗体（一抗）体（一抗）-------酶连接的第二抗体（也可接的第二抗体（也可预先包被抗体，先包被抗体，“吸附吸附”抗原），再抗原），再进行行酶-底物反底物反应。

反反应后通后通过专门的的酶标仪测定、定、记录数据二）酶联免疫吸附分析（二）酶联免疫吸附分析（（Enzyme-linked immunosorbent assay，，ELISA））受检标本+固相载体表面的抗原或抗体起反应——结合特异抗体（一特点：特点：1、具有特异性；、具有特异性；2、灵敏度很高；、灵敏度很高；3、、稳定、操作定、操作简便，便，标本用量少，适于大本用量少，适于大规模模筛查，， 尤尤 其适用于其适用于检测体液中微量的特异性抗体或抗原；体液中微量的特异性抗体或抗原；4、既可以做定性、既可以做定性试验也可以做定量分析也可以做定量分析 酶联免疫吸附分析酶联免疫吸附分析特点： 酶联免疫吸附分析 免免疫疫组织化化学学（（immunohistochemistry））是是利利用用标记的的特特异异性性抗抗体体通通过抗抗原原-抗抗体体反反应和和显色色反反应，，在在组织或或细胞胞原原位位检测特特定定抗抗原原（（即即目目标蛋蛋白白质））的的方方法法，，简称称为免免疫疫组化化实验近近年年来来由由于于荧光光标记抗抗体的广泛体的广泛应用，用，这两种方法又被两种方法又被统称称为免疫免疫荧光法光法。

三）免疫组化实验对组织（三）免疫组化实验对组织/ /细胞细胞 表达的蛋白质进行原位检测表达的蛋白质进行原位检测 免疫组织化学（immunohistochem基因表达分析技术人皮肤角化细胞免疫荧光染色人皮肤角化细胞免疫荧光染色人皮肤角化细胞免疫荧光染色Ø（（immunofluorescence）），，可可应用用荧光光（（倒倒置置））显微微镜或或激激光光共共聚聚焦焦显微微镜（（confocal microscopy））对靶靶分分子子进行行定定性性、、定定量量和和定定位位分分析析，，激激光光共共聚聚焦焦显微微镜还可可进行行断断层成像，是在蛋白成像，是在蛋白质水平分析基因表达的直水平分析基因表达的直观方法Ø其其中中抗抗体体对于于蛋蛋白白质靶靶点点的的特特异异性性、、种种间交交叉叉反反应、、检测系系统的的灵灵敏敏性性以以及及细胞胞或或组织的的固固定定类型型是是该方方法法的的关关键因素Ø运运用用双双重重着着色色或或多多重重着着色色程程序序同同时对多多个个感感兴趣趣的的靶靶分分子子进行行检测，，是是一一种种揭揭示示更更多多有有关关细胞胞群群的的功功能能和和它它们之之间相互作用信息的有效方法。

相互作用信息的有效方法Ø免免疫疫组化化主主要要是是作作为定定性性、、定定位位的的技技术，，若若结合合密密度度计量量系系统、、图像分析系像分析系统等等测量工具也可以得到定量的数据量工具也可以得到定量的数据immunofluorescence ），可应用荧光（倒置） 流流式式细胞胞术（（flow cytometry））在在细胞胞水水平平分分析析特特定定蛋蛋白白质的的基基本本原原理理也也是是抗抗原原-抗抗体体反反应，，它它利利用用荧光光标记抗抗体体与与抗抗原原的的特特异异性性结合合，，经过流流式式细胞胞仪分分析析荧光光信信号号，，从从而而根根据据细胞胞表表达达特特定定蛋蛋白白质的的水水平平对某某种种蛋蛋白白质阳阳性性细胞（即特异基因表达的胞（即特异基因表达的细胞）作出判断胞）作出判断四）流式细胞术用于分析细胞（四）流式细胞术用于分析细胞 特异表达的蛋白质特异表达的蛋白质 流式细胞术（flow cytometry）Ø流流式式细胞胞术可可以以检测活活细胞胞，，也也可可以以检测用用甲甲醛固固定定的的细胞Ø广广泛泛应用用于于细胞胞表表面面和和细胞胞内内分分子子表表达达水水平平的的定定量量分分析析，，并能并能够根据各种蛋白根据各种蛋白质的表达模式区分的表达模式区分细胞胞亚群。

群Ø此此外外，，流流式式细胞胞术可可以以使使用用多多个个荧光光标记的的抗抗体体同同时对多多个个基基因因产物物进行行标记和和监测，，是是对细胞胞进行行快快速速分分析析、、分分选、特征、特征鉴定的一种有效方法定的一种有效方法流式细胞术可以检测活细胞，也可以检测用甲醛固定的细胞是是将将具具有有高高度度亲亲和和特特异异性性的的探探针针分分子子（（如如单单克克隆隆抗抗体体））固固定定在在基基片片上上，，用用以以识识别别复复杂杂生生物物样样品品溶溶液液中中的目标多肽；的目标多肽；蛋蛋白白质质功功能能芯芯片片可可用用来来研研究究蛋蛋白白质质修修饰饰、、蛋蛋白白质质-蛋蛋白白质质/DNA-蛋蛋白白质质/RNA-蛋蛋白白质质，，以以及及蛋蛋白白质质与与脂脂质质、、蛋蛋白白质质与与药药物物、、酶酶与与底底物物、、小分子小分子-蛋白质等的相互作用蛋白质等的相互作用（五）蛋白质芯片分析蛋白质表达谱（五）蛋白质芯片分析蛋白质表达谱（（高通量地分析基因表达高通量地分析基因表达））蛋白质芯片蛋白质芯片(protein chip)是将具有高度亲和特异性的探针分子（如单克隆抗体）固定在基片上蛋白蛋白质检测芯片包括芯片包括: :1.1.抗体芯片抗体芯片2.2.抗原芯片抗原芯片3.3.配体芯片等配体芯片等蛋白质检测芯片包括: 目前比目前比较和和鉴定蛋白定蛋白质表达表达谱更多采用双向更多采用双向电泳泳（（two-dimensional electrophoresis, 简称称2-D电泳）泳）结合合质谱技技术。

原理原理: 根据蛋白根据蛋白质分子的两个属性分子的两个属性——等等电点和分子点和分子质量量——将蛋白将蛋白质混合物混合物进行分离电泳泳结果果经染色后，即可染色后，即可对不同不同样品中蛋白品中蛋白质的表达的表达谱进行比行比较；；还可从凝胶中将特可从凝胶中将特定的蛋白定的蛋白质点切下，点切下，经胰蛋白胰蛋白酶消化后得到短消化后得到短肽片段，利片段，利用用质谱（（mass spectrum）技）技术进行定性分析，行定性分析，对差异表差异表达的蛋白达的蛋白质进行行鉴定 可同可同时分离数成百上千的蛋白分离数成百上千的蛋白质六）双向（六）双向电泳泳结合合质谱普遍用于蛋白普遍用于蛋白质表达表达谱的分析和的分析和鉴定定 目前比较和鉴定蛋白质表达谱更多采用双向电泳（tw 双双 向向 电电 泳泳 技技 术术Two-dimemsional gel electrophoresis, 2DE技术构成：第一相：IEF 采用丙烯酰胺与不同PH的两性 电介质形成的固定的PH梯度– IEF- PAGE第二相：分子筛凝胶 SDS- PAGE特点：1. 一次分离细胞中几乎所有的蛋白质（以spot形式出现）2. 高灵敏度和高分辨率 用银染条件下，可达10-15——10-18 mol水平3. 便于计算机分析处理 电泳分离图谱经扫描输入计算机，可以进行蛋白质定位, 等电点,分子量定量不同条件下的图谱进行比较,建立蛋白质组数据库 双 向 电 基因表达分析技术基因表达分析技术基因表达分析技术基因表达分析技术质质 谱谱 技技 术术 质谱仪质谱仪 进样系统进样系统 离子源离子源 质量分析器质量分析器 离子探测器系统离子探测器系统质 谱 技 术 质谱仪在蛋白质组学研究中常用的质谱仪在蛋白质组学研究中常用的质谱仪•电喷雾离子化质谱仪（电喷雾离子化质谱仪（ESI-MS））•基质辅助的激光解吸离子化－飞行时间质谱仪基质辅助的激光解吸离子化－飞行时间质谱仪•（（MALDI-TOF-MS））•四极杆四极杆-TOF质谱仪（质谱仪（Q-TOF））在蛋白质组学研究中常用的质谱仪电喷雾离子化质谱仪（ESI-M质谱技术在蛋白质组研究中的作用质谱技术在蛋白质组研究中的作用•1. 肽质谱和肽的序列分析肽质谱和肽的序列分析•2. 翻译后修筛的蛋白质鉴定翻译后修筛的蛋白质鉴定• N端封闭，磷酸化，糖基化端封闭，磷酸化，糖基化•3. 其它：其它：•蛋白质二硫键的定量和定位蛋白质二硫键的定量和定位•蛋白质蛋白质——蛋白质相互作用的分析蛋白质相互作用的分析•蛋白质蛋白质——其它分子相互作用的分析其它分子相互作用的分析•蛋白质二级结构的分析蛋白质二级结构的分析•比较不同条件（正常细胞与异常细胞，不比较不同条件（正常细胞与异常细胞，不同发育阶段同发育阶段•从中获得单个有价值的蛋白质结构与功能从中获得单个有价值的蛋白质结构与功能质谱技术在蛋白质组研究中的作用1. 肽质谱和肽的序列分析标签融合标签融合蛋白沉淀蛋白沉淀实验流程实验流程示意图示意图标签融合蛋白沉淀实验流程示意图 白质相互作用研究领域里得到极大的推广。

白质相互作用研究领域里得到极大的推广GSTGST融合蛋融合蛋白在经过固定有白在经过固定有GST(glutathione)GST(glutathione)的色谱柱时，就可以通的色谱柱时，就可以通过过GST GST 与与GSHGSH的相互作用而被吸附当再有细胞抽提物过的相互作用而被吸附当再有细胞抽提物过柱，就可得到能够与柱，就可得到能够与“诱饵诱饵”蛋白相互作用的兴趣蛋白蛋白相互作用的兴趣蛋白一般来说一般来说GSTGST融合蛋白融合蛋白pull-downpull-down方法用于两个方面：方法用于两个方面： 一是鉴定与已知融合蛋白相互作用的未知蛋白质一是鉴定与已知融合蛋白相互作用的未知蛋白质 二是鉴定两个已知蛋白质之间是否存在相互作用二是鉴定两个已知蛋白质之间是否存在相互作用 白质相互作用研究领域里得到极大的推广GS（二）酵母双杂交技术的基本原理和用途（二）酵母双杂交技术的基本原理和用途（二）酵母双杂交技术的基本原理和用途基因表达分析技术电 泳泳 迁迁 移移 率率 变 动 测 定定 ( (electrophoretic mobility shift assay，，EMSA)或或称称凝凝胶胶迁迁移移变动实验( (gel shift assay)最最初初用用于于研研究究DNA结合合蛋蛋白白与与相相应DNA序序列列间的的相相互互作作用用，，可可用用于于定定性性和和定定量量分分析析，，已已经成成为转录因因子子研研究究的的经典典方方法法。

目目前前这一一技技术也也被被用用于于研研究究RNA结合合蛋蛋白白和和特特定定RNA序序列列间的相互作用的相互作用DNA-蛋白质相互作用分子分析技术蛋白质相互作用分子分析技术（一）电泳迁移率变动测定（一）电泳迁移率变动测定电泳迁移率变动测定(electrophoretic mobi放放射射自自显显影影未结合探针未结合探针结合有蛋白的探针结合有蛋白的探针标记探针标记探针1X1X1X1X核蛋白提取物核蛋白提取物1X10X10X未标记探针未标记探针10Xn凝胶迁移实验结果示意图凝胶迁移实验结果示意图放射自显影未结合探针结合有蛋白的探针标记探针1X1X1X1X染染色色质免免疫疫沉沉淀淀技技术(chromatin immunoprecipitation assay, ChIP)是是目目前前可可以以研研究究体体内内DNA与与蛋蛋白白质相相互互作作用用的的主要方法主要方法二）染色质免疫沉淀法（二）染色质免疫沉淀法染色质免疫沉淀技术(chromatin immunoprecn染色质免疫沉淀实验流程及结果示意图染色质免疫沉淀实验流程及结果示意图染色质免疫沉淀实验流程及结果示意图Analysis of DNA:Protein Interactions Antibody-Based ChIPAnalysis of DNA:Protein InteraChromatin immunoprecipitation (ChIP) HaloCHIP™ System—an Antibody-Free Approach HaloCHIP™ System—an Antibody-Free Approach Chromatin immunoprecipitation 。