乳腺癌雌激素受体基因的突变与变异.doc

1乳腺癌雌激素受体基因的突变与变异多年来，雌激素受体（ER）被作为乳腺癌内分泌治疗和预后评估的一个重要指征然而，异常的 ER 结构可能对于正确地评估 ER 状况显得尤为重要因为虽然可以检测出异常结构 ER 的存在，但实际上它缺乏其功能，从而导致假阳性结果同样，一些不能通过生化及免疫组化检测出来而实际上具有生物学活性的 ER 的存在也会导致假阴性结果因此，探讨 ER 的突变和变异状况具有重要意义例如，不需要配体就能传送雌激素信号的受体蛋白存在可能就会导致对内分泌治疗的抵抗；此外，功能不良的 ER 的突变也可能导致乳腺癌的预后不良一、野生型雌激素受体结构和功能ER 基因定位于 q24 和 q27 之间的第 6 对染色体的短臂上，由 8 个外显子组成野生型 ER 蛋白的相对分子质量大约为 65 000，与雌二醇具有很高的亲和性［1 ］ ER 属于配体激活的核转录因子的大家族，后者包括其他的类固醇激素受体、甲状腺激素受体、视黄酸受体、维生素 D 受体和大量尚未明确配体的所谓“孤立受体”用 A～F 6 个字母分别代表这些受体序列排列中的 6 个区域E 区主要组成了配体结合区，该区包括外显子 4 到 8 和装配配体结合的一个疏水区。

DNA 结合区包括二个锌指结构，使其能够与上游雌激素依赖基因启动区的特异性雌激素反应元件或单元（HRE）相协2调［2，3］ ，外显子 2 和 3 编码该区域，具有激活功能的为 AF1 和AF2 两个转录区AF1 包括 A、B 区的大部分，核受体含有两个转录激活功能（AF）区，分布位于受体 C 端的激素结合区（AF2）和N 端区（AF1） ，AF2 为激素依赖性，而 AF1 是激素非依赖的AF2还是核受体与其他转录介导因子（共激活因子或共抑制因子等）相互作用的部位甾体激素受体的每个 AF 均具有明显的细胞特异性特点，即使对于某一特定的靶基因而言，靶基因启动子的组成特性也能影响 AF（特别是 AF2）的转录活性D 区包括核的定位信号，即所谓的“桥接区” ，它并不依赖于配体结合当激素进入细胞后，与受体结合为复合物激素-受体复合物活化需要一定的温度，至于激素与受体的结合在胞质还是在核内尚有争论活化的复合物与 DNA 结合，这种结合具有选择性，与DNA 顺序有关这一结合部分称为 HRE.HRE 可能由不连续的若干单元组成，其位置不论是在所调节基因转录起始单元的 3＇-末端还是 5＇-末端方向都有作用。

根据这些表现，可以认为 HRE 属于调节基因中的增强子激素特异性在于细胞内的特异受体由于激素－受体复合物与 HRE 结合，引起 DNA 构象改变，活化了附近的启动子，从而促使转录当受体活性化或转化后，其产物作用于染色质的特殊部位，并通过各种酶和激活的 RNA 聚合酶的活性促进核酸的迅速复制，转录特殊基因信息而合成特殊蛋白质减弱染色体DNA－ 组蛋白的结合，激活基因而增强其模板活性，进而促进3RNA 转录和蛋白质的合成ER 与它的同源配体（主要为雌二醇）结合后引起一系列的受体激活步骤：包括受体与热休克结合蛋白的脱离，大量丝氨酸和酪氨酸残基以及二聚体的磷酸化激活的受体复合物与 HRE 序列的回文结构相结合，随后通过 ER 的 AF1 和 AF2 区与其他的转录成分的蛋白－蛋白结构形成激活转录过程缺乏配体结合区的重组缺失突变能够与 HRE 相结合而激活其转录，这表明了 AF1 的基本活性，不过此活性水平比激活的野生型受体要低得多相比较而言，AF2需要配体的存在来获得转录活性，但其活性程度取决于结合配体的性质［4-6］ 由于 DNA－AF1 结合引起兴奋作用，而三苯氧胺能拮抗雌激素对 AF2 的作用，三苯氧胺和类似化合物的混合兴奋活性可能部分是由于导致了 ER 的二聚化作用［7］ 。

有证据表明，不同的激活剂和辅阻遏剂可明显地影响诸如三苯氧胺的混合兴奋剂的反应水平［8，9］ 这种复杂的雌激素信号分子途径表明 ER 的突变和变异在不同组织之间有很大不同，也较难预言二、雌激素受体基因的突变这里的突变概念是指 ER 基因的 DNA 序列发生了变化，而变异是指在 mRNA 或蛋白水平上发生的异常改变，并不涉及 DNA 的编码异常这样的受体除本身功能降低或丧失外， 还有可能与正常4受体竞争配体、DNA 上的结合部位及转录因子等，从而使细胞对相应激素不产生反应此外，由于三苯氧胺是借助于与雌激素竞争结合受体发挥作用，所以，也就导致这样的乳腺癌对三苯氧胺的治疗不敏感实验发现完全性的功能性 ER 基因丢失会导致雌性鼠的乳头导管发育不全［10］ Mahfoudi 等［11］发现在鼠的 ER 基因538 和 552 位点之间发生的点突变能降低其雌激素依赖性转录活性，但并不明显影响激素或 DNA 的结合然而，这些突变却能戏剧性地改变雌激素拮抗剂的药物学效应；在表达这些突变的 Hela 细胞中，三苯氧胺和纯类固醇性抗雌激素 ICI164384 都变成了强烈的兴奋剂也有人在 Leu540Gln 突变中发现了类似的现象。

由于这样突变的受体一方面丧失了对其配体的正常生理性结合，另一方面，通过受体非配体依赖性激活的方式，可能就起到了类似促细胞分裂增殖的病理生物学效应，因此这样所谓的“阳性”ER 实际上缺乏了它原有的生物学作用，从而降低或丧失了对激素即雌激素的反应性但除了显示对抗雌激素药物的兴奋反应外，这种突变也同时显示对雌二醇的拮抗作用这种 AF2 突变现象在理论上可以解释某些乳腺癌对三苯氧胺治疗不敏感的原因［12］ Wolf 和 Jordan ［13］报道了一个 MCF－7 人乳腺癌的异种移植体，这是对三苯氧胺已经获得了抵抗、却能在三苯氧胺的刺激下进行生长结果发现它含有在 ER 配体结合区域的突变，是由于基因 351 位点上的天门冬氨酸被酪氨酸所替代进一步研究发现，5用突变的 ER 转染的 MDA－MB－231 细胞对三苯氧胺的反应与对雌激素的反应相似因此，自发性的或实验性的 ER 突变均表明这些畸变会影响乳腺癌对内分泌治疗的敏感程度Karnik 等［14 ］研究了 143 例家族性乳腺癌或卵巢癌病人的 ER 突变情况，利用SSCP－PCR 等方法发现其中 3 例有在 AF1 的 Gly160Cys 干系替换。

这种现象也发生在对照组白细胞 DNA 中，表明这可能反映了它的多态性，只有 5 个在外显子 1、3～5 和 8 的第三对碱基的替换发生，但也被认为是多态性缘故，因为这种情况与肿瘤的激素受体或与三苯氧胺的抵抗状况无关，也未伴随有保守的体细胞系突变Roodi 等［15］调查了 118 例 ER 阳性和 70 例 ER 阴性癌中的 ER 突变情况，发现了 2 例错义突变，5 例多态性被检测出，但没有 1 例与临床病理学特征有关总之，以上这些研究所发现的突变仅占极少部分与这些结果不同的是，在 30％以上的乳腺增生过长和其相应的正常组织中检测到有 ER 突变，但在未发生病变的正常乳腺组织中未发现有突变位于外显子 4 上的赖氨酸替换成精氨酸的突变会引起 MCF－7 细胞对雌二醇的增殖反应性增加 200 倍以上，但这种现象是发生在乳腺良性增生性疾病中，至于在乳腺癌中的类似突变尚未见报道因此，这样低的 ER 突变频率是难以解释乳腺癌对激素抵抗的现象，至少也不可能对常规的临床检测病例中作出能足以说明问题的解释6三、雌激素受体基因的的变异有大量的乳腺癌 ERmRNA 变异型报道，在正常乳腺组织和其他器官中也有发现。

较多的主要是桥接变异，发生 ERmRNA 的1 个或几个外显子缺失，其他的有隐蔽的桥接变异，发生了新的架接连接，以及外显子的复制，或转录中有非 ER 性的序列产生这些结果主要导致转录信息的丢失，翻译紊乱，或者引起转录蛋白结构的不完整，原因是非 ER 序列中出现的终止转录编码目前研究较多的是外显子 5 的变异情况用它的变异现象来解释 ER-/孕激素（PR）+乳腺癌的存在，因为 PR 的表达是高度依赖于雌激素源性的信号Fuqua 等［ 16］发现 4 例 ER-/PR+乳腺癌中有 3 例的外显子 5mRNA 水平比野生型 ERmRNA 要高得多相对而言，在 5例 ER/PR 均阳性的肿瘤中，其结果却相反尽管这种是外显子 5 缺乏的变异，但这足以引起翻译后蛋白序列结构的改变，引起蛋白长度被截短，相对分子质量也只有 40 000，缺乏配体结合区域当这种变异转染到 MDA－MB －231 乳腺癌细胞后，它能激活 HRE 接近 60％ 野生型受体的效率，它并不依赖于雌激素配体，也不受雌激素拮抗剂的影响重要的是，从 ER 阴性，PR 弱阳性的 BT20乳腺癌细胞中已抽提出了外显子 5 蛋白，这是在非转染细胞的蛋白水平上缺失变异的唯一证据。

另一个实验是用外显子 5 变异转染的 MCF－7 细胞，其生长7速度比用质粒转染的对照组要快得多，而且 PR 水平也高于野生型的细胞［17］ ，而且它可抵抗 4－羟基三苯氧胺的处理，其原因可能是这种变异能够与野生型受体形成二聚体从而不受三苯氧胺的调节作用临床的资料也进一步佐证，在 ER－ /PR+ 或 ER－及其他的雌激素依赖蛋白（如 pS2）的肿瘤中，发现有较高频率的变异情况，因而认为这种变异对 PR 和 pS2 表达有活性作用也有报道外显子的丢失会引起受体功能丧失Dotzlaw 等［18 ］发现了外显子 2或 3 截短的变异，当将其共同转染到 COS－1 细胞后，未见有转录发生，所以即使 DNA 结合区域完好，但当有 ER 基因的截短变异发生时，将导致无功能性受体的产生有人在子宫绒毛膜上皮癌和胚胎癌中也发现了类似情况，外显子 7 的丢失变异也可使转录过程丢失，当在酵母表达载体系统中表达时可抑制其野生型 ER 的转录活性［19］ 由于在几乎一半的 ER+/PR－的肿瘤中发现这种现象，说明这种变异可能主要出现在 ER 功能阴性的肿瘤中，导致所谓 ER+的肿瘤对雌激素的反应性降低由此可见，通过肿瘤的 ER 变异情况可联系其预后状况，不过这需要丰富的临床资料来证实。

由于所发现的 ER 变异均是在 mRNA 水平上，缺乏相应蛋白水平上的证据，有人怀疑这与是否用极其敏感的 RT－PCR 导致的实验假象有关，认为这是 ER 基因转录中的正常过程但事实上，目前所发现的这些变异是具有组织特异性的，而且其受体超家族的其余成员没发生变异8总之，对于实验中发现的 ER 点突变可能对其蛋白功能有明显的影响，但就联系临床上乳腺癌的发展和其表现型来看，至少目前的证据还很难证实而 ER 的变异主要是在 mRNA 水平上，鉴于缺乏相应蛋白水平的依据，对于这种变异的临床意义还值得进一步探讨参考文献1 Green S， Walter P， Kumar V， et al. Human oestrogen receptor cDNA： sequence， expression and homology to v-erb-A. Nature， 1986， 320：134-139.2 Ponglikitmongkol M， Green S， Chambon P. Genomic organization for the human oestrogen receptor gene. EMBO J， 1988，7 ：3385-3388.3 Green S， Chambon P. Oestradiol induction of a glucocorticoid-responsive gene by a chimaeric receptor. Nature， 1987， 325：75-78.4 Kumar V， Green S， Stack G， et al. Functional 9domains of the human estrogen receptor. Ce。