宫颈癌组织高危HPV18 L1基因的克隆及序列分析.doc

1宫颈癌组织高危 HPV18 L1 基因的克隆及 序列分析【摘要】 目的 克隆和分析人乳头瘤病毒 18 型晚期表达基因 L1 序列，为 HPV 感染的检测和基因工程疫苗研制提供基础方法 采用 PCR 技术扩增了 1 例 HPV18阳性宫颈腺癌患者癌组织中 HPV18 L1 基因，并对其进行了克隆及全序列分析结果 本例宫颈癌临床标本 HPV18 L1 基因与 GenBank 收录的原型比较有 12 个碱基变异，推导其编码的氨基酸也发生了变化结论 本例中国人宫颈癌 HPV18 L1 基因有一定的变异 【关键词】 人乳头瘤病毒 18 型 L1 基因 宫颈癌 克隆0 引言人乳头瘤病毒(human papillomavirus, HPV)感染是最常见的性传播疾病之一，至今，已发现 100 多型 HPV，近半数可感染生殖道其中，HPV 16、18、31、33、35和 58 等型因与宫颈癌等恶性肿瘤的发生发展密切相关而归属高危群虽然 HPV18 是世界大部分地区宫颈癌患者中次于 HPV16 的第二位常见高危HPV[1，2]，但 HPV18 较 HPV16 具有更强的恶性转化能力[3]HPV 感染的控制关键在于疫苗的发展。

HPV 晚期基因 L1 编码的病毒主要衣壳蛋白 L1 是病毒的重要抗原, 能刺激机体产生保护性抗体,故 L1 基因已被用于制备 HPV 疫苗[4]由于 HPV 不能在体外经组织培养增殖，故而 L1 基因的克隆和表达对基因工程疫苗及诊断试剂的研制具有重要意义本实验对来自陕西省的一例宫颈腺癌患者手术标本中的 HPV18 L1 基因进行了克隆及一级结构分析21 材料与方法1.1 材料1.1.1 标本 DNA 选取我们用 TDI FP 分型方法[1]鉴定出的一例 HPV18 阳性宫颈癌 DNA患者源自西安交通大学第二医院妇产科，42 岁经病理诊断为腺癌, 按 FIGO 分期为Ⅱa 期取材前未接受化疗和放疗1.1.2 菌株及主要试剂 DH5α 大肠杆菌细胞株为第四军医大学全军基因诊断研究所保存，克隆载体连接试剂盒（pGEM T Easy Vector System I，内有 T4 连接酶）和质粒提取试剂盒（Wizard Plus Minipreps DNA Purification System）购自美国 Promega 公司，Taq DNA 聚合酶、限制性内切酶 Hind Ⅲ及 SacⅠ、DNA marker（DL2000）、异丙基硫代 β D 半乳糖苷（IPTG）和 5 溴 4 氯 3 吲哚β D 半乳糖苷（X gal）、dNTP 混合物购自大连宝生物公司，电泳凝胶片段回收试剂盒（CONCERTTM Rapid Gel Extraction System）购自美国 GIBCO 公司。

蛋白酶 K、RNA 酶购自洛阳华美生物工程公司引物和寡核苷酸探针由北京赛百盛公司合成1.2 方法1.2.1 PCR 扩增 HPV18 L1 基因 HPV18 L1 ORF 全长引物依据 GenBank 设计上游引物外设 SacⅠ酶切位点和保护碱基 CG，下游引物外设 Hind Ⅲ酶切位点和保护碱基 GC该引物扩增的靶序列全长 1707bpPCR 以从宫颈癌组织中提取的总 DNA 作为模板, 总体系 25μl, 内含 dNTP0.25mmol·L-1，引物各 0.25μmol·L-1，MgCl2 2.5mmol·L-1，Taq 酶 2.5U扩增条件：94℃变性 5min 后，进行 35 个循环：94℃ 40s, 56℃ 40s, 72℃ 2min, 末次循环后 72℃延伸 7min31.2.2 HPV18 L1 基因的克隆和测序 将 PCR 产物经含溴化乙锭的 1.5%琼脂糖凝胶电泳后，紫外灯下看到 1707bp 的 L1 扩增带，将含有相应片段的凝胶切下置入 1.5ml Eppendorf 管中，分别严格参照电泳凝胶片段回收试剂盒及克隆载体连接试剂盒（pGEM T Easy Vector System I）说明回收目的片段，并将目的片段与克隆载体 pGEM T Easy 连接，构建 HPV18 L1 pGEM T 重组质粒，转化至CaCl2 法制备的大肠杆菌 DH5α 感受态细胞中。

在含有 IPTG 和 X gal、氨苄青霉素阳性的 LB 琼脂平皿中蓝白筛选， 随机挑取 3 个白色单菌落扩大培养，按Wizard Plus Minipreps DNA 纯化试剂盒说明书步骤小量提取重组质粒，并进行酶 Hind Ⅲ及 SacⅠ双酶切鉴定含有 1707bp（L1）外源 DNA 片段的克隆为阳性克隆，送上海 Sangon 生物工程公司进行 DNA 序列测定，对测序结果进行分析2 结果2.1 HPV18 L1 基因的 PCR 扩增 从宫颈癌组织中提取的总 DNA 作为模板，用合成的 HPV18 L1 引物进行 PCR 扩增，产物在 1.5%的琼脂糖凝胶电泳分析，可见一条清晰的扩增带，见图 1，与预计的片段大小一致，为 1 700bp 左右2.2 重组质粒的构建及双酶切鉴定 目的片段回收后与线性克隆载体pGEM T Easy 连接，构建了 HPV18 L1 pGEM T 重组质粒将重组质粒经转化及 HindⅢ和 SacⅠ双酶切鉴定筛选出阳性克隆酶切电泳结果如图 2，可见重组质粒的插入片段与预计的 1 707bp 片段大小一致图 1 HPV18 L1 基因 PCR 产物的电泳分析（略）4图 2 重组质粒 HPV18 L1 pGEM T 的双酶切鉴定（略）2.3 重组质粒的序列测定和分析 将含重组质粒的阳性克隆经上海 Sangon 生物工程公司自动测序仪行正、反双向测定，拼接出 L1 完整序列，推导出相应的 L1 蛋白质氨基酸序列。

经 blast 同源性分析证实，克隆获得的 HPV18 L1 基因从起始密码子（ATG）到终止密码子（TAA）共 1 707bp, 与 GenBank 收录的(收录号： X05015 )、由 Cole 等[5]报道的原型（prototype）比较，有 12 个碱基发生了变异，推导其蛋白质一级结构中可能有 11 个氨基酸发生改变，见表 1 3 讨论近 20 年来对宫颈癌的病因及癌变机制的研究表明 HPV 是宫颈癌的主要致癌因素，近 99%的宫颈癌组织中可检出 HPV DNAHPV16 和 HPV18 是宫颈癌中最常见的高危型 HPV，检出率达 50%～90%[1, 2]体外研究发现，与 HPV16 相比，HPV18 的恶性转化及使细胞永生化的能力更强[3]据报道 HPV18 相关的宫颈癌癌前病变进程更快[6]HPV18 也是宫颈癌再发的独立危险因素[7]，且与宫颈腺癌显著相关[8]，HPV18 相关宫颈癌早期诊断率低、预后差因此，控制 HPV18 感染必将能减少 HPV18 感染相关肿瘤的病死率表 1 宫颈腺癌样本中 HPV18 L1 基因突变分析（略）到目前为止，对 HPV 感染所致的疾病尚无特异的抗病毒治疗方法，其控制关键在于开发 HPV 疫苗。

由于 HPV 不能在体外培养增殖，相关基因/蛋白的获得只能依赖基因工程重组及表达系统HPV 晚期基因 L1 编码的病毒主要衣壳蛋白 L1是 HPV 的重要抗原，多种 HPV 重组 L1 蛋白能够自发折叠成病毒样颗粒（VLP），免疫机体后可刺激 B 淋巴细胞产生中和抗体，从而阻断 HPV 病毒感染，故而 L15基因及蛋白已成为基因工程疫苗研制的重要靶向基因和蛋白[4]已知各型 HPV 有多种变种（variant）存在，即 HPV 基因呈高度多态性，这种多态性与地理位置有关,且因人群遗传背景差异而与疾病的相关关系不同[9]本例HPV18 L1 基因序列较 GenBank 收录的源自巴西的原型[5]比较有 12 个碱基发生突变，推导出的 L1 蛋白一级结构中的氨基酸 11 个发生了变化L1 基因变异导致的 L1 蛋白一级结构变化对蛋白功能，尤其蛋白免疫原性的影响尚需深入研究在对 HPV 检测及疫苗研制时应考虑到基因变异可能的影响本实验从西安地区 1 例宫颈腺癌患者临床标本中成功地克隆到了 HPV18 型L1 基因，该基因的成功克隆为其相应蛋白表达的后续工作奠定了基础，并对疫苗的进一步研制，以及开发具有诊断或预防功能的生物制剂都具有重大意义。

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