十一食品中黄曲霉毒素B1的检测.doc

实验二十、食品中黄曲霉毒素B1的产生与检测标准依据：GB/T5009.22-2003食品中黄曲霉毒素B1的测定一、实验目的与要求：1、学习酶联免疫(ELISA)方法测定粮食及食品中黄曲霉毒素B1的实验原理，掌握实验的操作要点及测定方法2、了解酶联免疫(ELISA)的工作原理，正确熟练使用酶标仪二、实验原理：本试剂盒采用间接竞争ELISA方法，样品中的黄曲霉毒素B1经提取、脱脂、浓缩后与定量特异性抗体反应，多余的游离抗体则与酶标板内的包被抗原结合，加入酶标记物和底物后显色，与标准曲线比较测定含量三、仪器与试剂：（一）试剂盒组成1、 AFB1抗原包被16孔6条形带框酶标板；2、抗体；3、酶标二抗；4、空白对照液；5、底物（1mg4）；6、底物液A；7、底物液B；8、终止液；9、PBS一T洗液；10、一次性手套（2副）二）仪器1、酶标仪； 2、离心机四、实验步骤：（一）样品中AFB1的提取1． 大米和小麦（脂肪含量＜3.0％）：样品粉碎后过20目筛，称取20.0g，加入250m1具塞锥形瓶中准确加人60mL三氯甲烷，盖塞后滴水封严，150rpm振荡30min静置后，用快速定性滤纸过滤于50mL烧杯中，立即取12mL滤液（相当4.0g样品）于75mL蒸发皿中。

65℃水浴通风挥干用2.0mL甲醇一PBS (20+80)分三次（0.8mL、0.7mL、0.5mL）溶解并彻底冲洗蒸发皿中凝结物，移至小试管加盖振荡后静置待测此液每毫升相当2.0g样品2. 玉米（脂肪含量3.0～5.0％）：样品粉碎后过20目筛，称取20.0g，加入250mL具塞锥形瓶中准确加入50.0mL甲醇一水（80+20）溶液和15.0mL石油醚，盖塞后滴水封严，150rpm振荡30min用快速定性滤纸过滤于125mL分液漏斗中,待分层后，放出下层甲醇水溶液于50mL烧杯内，从中取10.0mL （相当于4.0g样品）于75mL蒸发皿中,以下按上述“65℃水浴通风挥干”起，依法操作3．花生（脂肪含量15.0－45.0％）：样品去壳去皮粉碎后称取20.0g，加入250mL具塞三角瓶中，准确加人100.0mL甲醇水(55 ＋45）溶液和30mL石油醚,盖塞后滴水封严，150rpm振荡30min，静置15min后用快速定性滤纸过滤于125mL分液漏斗中，待分层后，放出下层甲醇水溶液于100mL烧杯内，从中取20.0 mL（相当于4.0g样品）置于另一125mL分液漏斗中，加入20.0mL三氯甲烷，振摇2min，静置分层（如有乳化现象可滴加甲醇促使分层）．放出三氯甲烷于75mL蒸发皿中，再加5.0mL三氯甲烷于分液漏斗中重复振摇提取后，放出三氯甲烷层一并于蒸发皿中，以下按上述“65℃水浴通风挥干”起，依法操作。

4．植物油：用小烧杯称取4.0g样品，用20.0mL石油醚，将样品移于125mL分液漏斗中，用20.0mL 甲醇水(55 ＋45）溶液分次洗烧杯，溶液一并移人分液漏斗中精炼油4.0g样为4.575mL，可直接用移液器加入分液漏斗再加溶剂后振摇）振摇2min，静置分层后，放出下层甲醇水溶液于750mL蒸发皿中再用5.0mL甲醇水溶液重复振摇提取一次，提取液一并加入蒸发皿中，以下按自“65℃水浴通风挥干”起，依法操作5．其它食品：可按照G8 5009有关章节提供的方法操作，最终提取物（相当于4.0g样 品）应收集于2.0m1甲醇一PBS(20＋80)中二）样品测定1、将下列试剂稀释后备用PBS一T洗液：390mL蒸榴水稀释（1:40）；底物液A: 9mI蒸溜水稀释（1:9）；抗体: 7.0mL洗液稀释（1:140）；酶标二抗:10mL洗液稀释（1:200）；阴性对照液:200μl抗体十200μl空白对照液在玻璃试管内混合振荡后静置2、抗体抗原反应将抗体与等量样品提取液（溶液为甲醇一PBS）在玻璃试管内混合振荡后室温 静置15分钟启封酶标板，用洗液23分钟洗板后在吸水纸上拍干，分别在适当孔位加入此抗体抗原反应液及空白对照液（3孔）和阴性对照液（3孔）,130μl／孔,37℃湿盒中孵育（或加盖以保持相对湿度），2小时后，倒掉反应液并拍干,用洗液33分钟洗板，拍干。

3、酶标记反应加入酶标二抗，100μl／孔，37℃盒中孵育1小时后，用洗液53分钟洗板，拍干4、显色反应lmg底物十2.5m1底物液A ＋42μl底物液B，待底物充分溶解后加入酶标板，100μl／孔，37℃15分钟后加终止液40μl／孔5、测定酶标仪490nm测定各孔0.D值五、数据处理及计算结果：1、求出各孔的0.D校正值：0.D校正值＝O.D实测值一空白对照孔0.D值（均值）2、求出待测样的0.D％值：0.D％＝[O.D校正值/阴性对照孔0.D校正值（均值）］ 100％3、求出待测样AFB1含量（ng／g）：在标准竞争抑制曲线上找到待测样0.D％值（座标Y值）的对应点，该点座标X值的反对数（10x）即为样品中AFB1的含量（ng／g），见图1六、使用进口试剂盒检测的主要实验步骤1. 样品提取：取5.0g样品与锥形瓶中，加入70％甲醇25ml，振摇3min，过滤于分液漏斗中，静置分层，放出下层的甲醇水提取液，即为样品提取液亦可根据样品中黄曲霉毒素含量进行适当稀释为待测样液）2. 免疫反应：红色微孔中加入蓝色试剂100μl，分别加入标准品和样品各100μl，三次混匀，移100μl到白色抗体孔，摇匀，室温反应10min，弃去液体，用去离子水洗5次，用吸水纸扣干3. 显色反应：加入绿色试剂100μl，摇匀，室温反应10min，加入红色试剂100μl，终止反应。

4. 结果检测：在450nm处用酶标仪检测七、注意事项及说明：1、带手套操作酶标板用后处理，不能重复使用样品提取过程中用过的玻璃仪器需要重复使用时，应作解毒处理后,再洗涤 2、操作时应手持酶标板板框，避免液体等沾污板底部，以保持酶标洁度3、试剂盒如需分次使用，应在每次使用前根据用量稀释试剂，每次用多少稀释多少，剩下的酶标板和试剂，应及时封存，4℃保存备用如需保存较长时间则应-20℃保存 但反复冻融后，将导致抗体效价下降4、结果判定：根据参考资料三：现行国家食品（饲料）卫生标准中规定的AFB1允许量标准对检测样品AFB1污染程度进行判定5、具体分析还要根据试剂盒的具体要求八、思考题：1、简述ELISA方法定量检测黄曲霉毒素B1的原理？2、实验对样品进行前处理的作用？3、影响检测准确性主要有哪些因素？4、酶标仪操作过程要注意些什么？。