14_酶促反应动力学-多底物动力学p教学文案.ppt

第二节 多底物反应及其动力学一 反应机制的分类： (一) Cleland表示法的基本符号和概念：v底物：依照底物与酶结合的顺序依次用 A、B、C、D表示v产物：根据产物从酶上脱落的顺序用 P、Q、R、S 表示v游离酶：E、F、Gv抑制常数：KiA 、KiB ; KiP 、 KiQ v米氏常数：KmA、KmB; KmP 、 KmQ v抑制剂：I v修饰剂：X或Yv反应分子数: Uni(单) 、Bi(双)、 Ter(三) 、Quad(四)v酶反应中间物：分为两类 (1) 稳态中间物： 指酶和底物以共价键结合形成的较为稳定的中间物可以发生双分子反应而不能自身解离例如：某些Ser蛋白酶在催化过程中形成的酰化酶中间物 包括：共价结合的ES中间物；自由酶 (2) 过渡态复合物： 非稳定的酶中间物，本身可以单分子解离或异构化之后再解离出产物或底物 分为: 非中心复合物：酶未完全被底物饱和 中心复合物： 酶已经完全被底物饱和， (EAB EPQ); (EA EP) (二) 反应机制的分类和命名 (以双底物双产物反应为例）： 1. 序列(sequential)反应机制: 酶必需与所有底物都结合之后才有产物放出。

对于双底物双产物反应，必有酶-底物三元复合物形成v 根据底物及产物与酶的结合及释放是否有序分为: (1) 有序双双双底物双产物反应(ordered Bi Bi) ： A B P Q E EA (EABEPQ) EQ E v EA、EQ : 非中心复合物； (EAB EPQ) : 中心复合物v A：领先底物； B：随后底物 (2) Theorell- Chance (T-C 机制)： A B P Q E EA EQ E 第二个底物B结合及释放非常快，没有明显的三元复合物变构过程可看作是三元复合物浓度极低的序列有序机制 例如：马肝醇脱氢酶： NAD+ 乙醇 乙醛 NADH E ENAD+ E NADH E(3)随机双双(random Bi Bi)： A B P Q EA EQ E （EABEPQ） E B A Q Pv 产物从酶上的释放及底物和酶的结合无一定顺序v少数脱氢酶和一些磷酸激酶属于该类，例如肌酸激酶: 肌酸 + ATP 磷酸肌酸+ ADPv机制：酶蛋白上的A、B结合位均处于暴露状态， 两者与底物的结合即互不干扰，也不互相依赖EBEP2 乒乓机制(Ping-Pang Bi Bi)： 各种底物全部和酶结合以前 ，已经有一种或多种底物放出，不形成三元复合物。

A P B Q E (EAFP) F (FBEQ) Ev属于该机制的酶大多数具有辅酶，如转氨酶、黄素酶等谷草转氨酶属于典型的乒乓机制： Asp OAA AKG Glu ECHO (ECHOAsp ENH2 (ENH2AKG ECHO ENH2OAA) ECHOGlu) v总结： 有序机制 序列反应机制 T-C 机制 随机机制 乒乓反应机制二 King-Altman法速度方程图示法(一)Kappa表示法: E + A k1 EA 1 k-1 2 Vf= k1 A E ; Vr= k-1 EAv Kappa()= 速度常数项 底物(产物)浓度项 正向反应的Kappa：12 =k1 A 逆向反应的Kappa：21 =k-1 反应速度：Vf= 12 E ; Vr= 21 EA v 具有方向性，是一个矢量其方向与酶形式的 流向有关(二)King-Altman 法步骤: (1)首先写出反应历程，然后将反应历程安排成封闭环形式环的角数就是酶存在形式数目，用n表示然后在各角之间连线上标出各步反应的 E + A k1 EA k2 EP k3 E + P k-1 k-2 k-3 E k1A EA k-1 k-3P k3 k2 k-2 EP E = k-1k3 + k-1k-2 + k2k3 EA= k1k3 A + k1k-2A + k-2k-3P EP = k-1k-3P + k1k2A + k2k-3P E k1A EA k-3P k3 k-1 k2 k-2 EP E :EA:EP:（2）画出King-Altman 图形，即：所有流向各种酶形式的n1 线矢量图，再将各步反应的标到矢量图上,并写出流向 各种酶形式的乘积之和。

k-1 k3k-2k-1k3 k2k1Ak3k1Ak-2k-3Pk-2k-3Pk-1k1Ak2k-3Pk2（3）速度方程推导: v 各种酶形式的浓度与其乘积之和成正比: E E ; EA EA; EP EP E0 = E + EA + EP E = E E0 E = （E）E0 EA = EA E0 EA=（EA）E0 EP = EP E0 EP=（EP）E0 V = k3 EP k-3 E P = (k3EP /k-3 PE/ )E0 = (k1k2k3 A k-1k-2 k-3 P ) E0 (k-1k3+k-1k-2+k2k3)+k1(k2+k-2+ k3)A+k-3 (k-1+ k-2+k2)P = num1A num2P const + coefA A + coefP P num1 : 分子中A项之前的系数乘以E0 num2 : 分子中P项之前的系数乘以E0 const : 分母常数项 coefA : 分母中A项之前的系数 coefP : 分母中P项之前的系数 E k1A EA k-3P k3 k-1 k2 k-2 EP (三) 注意: 矢量图数目的计算 : n-1线矢量图数目= m! (n-1)!(m-n+1)! n=角数; m=封闭环的线数 n=3; m=3; n-1线矢量图数目= 3! =3 (3-1)!(3-3+1)! King- Altman 图形不包含封闭环形式： E1 E2 E3 E4 v n=4，m=5 n-1线（3线）图数目= 5！ =10个， (4-1)！(5-4+1)！ v 2个封闭环形式无效，应去除。

共有8个有效的 King- Altman 图形 反应历程中有时可能没有逆反应，此时有些 King-Altman 图形不存在 E + A k1 EA k2 EP k3 E + P k-1 k-2 此反应若没有k-3 线，则某些King-Altman 图形不存在，反应速度中凡是含k-3 项 者不存在K-3 E : k-1 k-1 k3 k3 k-2 k2 EA: k1A k1A k3 k-2 k-3P k-2 EP: k-1 k1A k-3P k2 k-3P k2 E = k-1k3 + k-1k-2 + k2k3 EA= k1k3 A + k1k-2A + k-2k-3P EP = k-1k-3P + k1k2A + k2k-3P E k1A EA k-3P k3 k-1 k2 k-2 EP V = k3 EP k-3 E P = (k1k2k3 A k-1k-2 k-3 P ) E0 (k-1k3+k-1k-2+k2k3)+k1(k2+k-2+ k3)A+k-3 (k-1+ k-2+k2)P = num1A num2P const + coefA A + coefP P 三 双底物反应动力学(一) 有序双双机制： 1 方程的推导： E + A k1 EA + B k2 (EABEPQ) k3 EQ + P k-1 k-2 k-3 k-4 k4 E + Q E k1A EA k-1 k4 k-4Q k-2 k2B k-3P EQ (EABEPQ) k3v n=4, m=4, 则n-1线(3线)矢量图数目为4 E : EA: EAB: EQ: k4 k1Ak-3Pk-1k1Ak-4Qk-4Qk-3Pk-3Pk2Bk2Bk2Bk-3Pk-1k-1k-1 k4 k4 k4 k3k3k2Bk-2k-2k-1k-1k1Ak-4Qk-4Qk-4Qk3k3k3k2Bk2Bk-2k1Ak1Ak1A k4 k4 k-4Qk-3Pk-3Pk3k-2k-2k-2V=k4EQ k-4EQ =(k4EQ k-4QE) E0 = num1AB - num2PQ const + coefA A + coefBB + coefPP + coef + coefABAB+coefAPAP+coefBQBQ +coefPQPQ + coefABPABP +coefBPQBPQv若不考虑产物的影响，即 P=0, Q=0 初速度V= num1AB const + coefAA + coefBB + coefABAB2 动力学常数的定义：v 最大反应速度： 正向：Vmf= num1 逆向：Vmr= num2 coefAB coefABv 米氏常数： KmA= coefB KmB= coefA coefAB coefAB KmP= coefQ KmQ= coefP coefPQ coefPQv 解离常数：KiA = const KiB = const coefA coefB KiP = const KiQ = const coefP coefQV = num1AB const + coefAA + coefBB + coefABAB = num1ABcoefAB const coefA + coefA A + coefB B + coefAB AB coefA coefAB coefAB coefAB coefAB V = VmfAB KiA KmB + KmBA + KmAB + AB v 双底物反应中米氏常数的意义： KmA：是B饱和时酶对底物A的米氏常数 KmB：是A饱和时酶对底物B的米氏常数3 有序机制动力学常数的求取(二次作图法)：v第一次为双倒数作图，一般固定其中一个底物的浓度，变化另一个（例如：固定B，变化A）。

将有序机制的动力学方程进行双倒数处理： 1 = KmA ( 1+ KmBKiA ) 1 + 1 (1+ KmB) V Vm KmAB A Vm Bv若将B固定于不同的浓度，则以 1/V 1/A 作图可得一组相交于第二 或第三象限的直线，其交点座标为： - 1 1 ( 1- KmA ) KiA , Vm KiA1/V1/AB1B2B3 纵截距为： 1 ( 1+ KmB ) Vm Bv第二次作图：纵截距1/B作图v由第二次的作图可知 KmB和Vm, 代入交点坐标中可知KmAv若A (A饱和时)： 1 = 1 (1 + KmB ) V Vm B 转化为米氏方程v若B (B饱和时): 1 = 1 (1 + KmA ) V Vm Av这就是水解反应可看作是单底物反应的原因，因为另一底物是水，其浓度可看作是饱和 纵截距 ： 1 ( 1+ KmB ) Vm B1/B1/Vm - 1 KmB(二) 随机双双： 1 动力学方程推导： m=8, n=6, n-1=5线图：56个 封闭环：24个 有效图形：32个 EAEBEPEQE(EABEPQ) v假设反应过程第一个底物与酶结合或第一个产物从酶释放是迅速平衡过程迅速平衡随机双双: V= num1AB - num2PQ const + coefA A + coefBB + coefPP + coef + coefABAB+coefPQPQv 若P=0 Q=0 则 : V = num1AB const + coefA A + coefBB + coefABAB V = VmfAB KiA KmB + KmBA + KmAB + ABv 此方程与有序机制相同，称为序列机制的总方程。

(三) 乒乓双双机制：1 速度方程: 乒乓机制的King-Altman环形表达式为： E k1A (EAFP) k-1 k4 k-4Q k2 k-2P (EQFB) k-3 F k3B vm=4 n=4，每种酶都有4种3线图 V= num1AB - num2PQ coefA A + coefBB + coefPP + coef + coefABAB+coefAPAP+coefBQBQ+ coefPQPQ v若不计产物影响，P=0 Q=0，则： V= num1AB coefA A + coefBB + coef。