2细胞培养及建立泡沫细胞模型.doc

2) 实验手段(1 )细胞培养及建立泡沫细胞模型将THP-1细胞宜于含10%胎牛血清的RPMII640培养基中，于370C, 5) CO:培 养箱静置培养该细胞株属人类单核细胞系,在培养液中呈簇集状悬浮生长,倍增时间 人约在26hfio细胞浓度控制在106/mL,每两天换液一次，每四犬传代一次细胞复苏 后，传至3 )=5代后方可用于建模2)建立巨噬细胞模型収对数生长期的细胞，分为正常组和模型组，调整细胞浓度为106/mL,接种于6孔培 养板，每孔2mLo正常组在含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培养液中培养模型组 先置于含160 nmol/L PMA的RPMI 1640基础培养液中培养72 h,贴舉后轻轻吸去上清液,PBS洗3遍，更换10%胎牛血•清的RPMI 1640完全培养液，即得巨噬细胞巨噬细胞 的鉴定己在发表文献中完成3)建立巨噬源性泡沫细胞模型将获得的巨噬细胞更换含3%胎牛血清的RPMI 1640培养液，并加入终浓度为80 mg/L的Ox-LDL,共同孵育48 h,汕红染色后，镜下观察细胞内充满橘红色脂滴，即得泡 沫细胞模型，此过程即为泡沫化⑷针对CaSR的si RNA的构建及转染根据公认的si RNA设计原则(Nat Biotech 2004; 22: 326-330)计针对CaSR的3条siRNA,选用验证后效果最好的一条。

同时合成阳性对照和阴性对照转染试剂选 用Invitrogen 公司生产的 LipofectamineTM RNAiMAX Transfection ReagentosiRNA目标序列的选取原则：工从转录本(niRNA)的AUG起始密码开始，寻找八AA"二连序列，并记下其3端 的19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点注意:GC含量在4_5 070-_5 _5%左右的siRNA 要比那些GC含量偏高的更为有效;在设计siRNA时不要针对_5和3端的非编码区Cuntranslated regions UTRs),原因是这些地方有丰富的调控蛋白结合区域，而这些UTR 结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响siRNP核酸内切酶复合物结合mRNA从而影siRNA的效果1) 细胞总RNA提取:按Trizol试剂盒说明书进行，具体操作步骤如下:在细胞中加入冰预冷的Trizol试剂,室温静置_5min;加200 } 1氯仿,充分摇匀1 _5sec,室温 静ffi 2-3 min ; 4 0C, 12000ipm离心1 _5 min,取上层无色水相层转移至新EP管;加等体 积异丙醉，室温静18 1 Omin ) 4 0C ) 12000rpm离心1 Omin,管舉底处可见乳白色沉淀,即为RNA;芥上清，加7 _5%乙醇1 ml } 4 0C } 7_500rpm离心_5 min,洗涤二次;弃上 层乙醇，无菌环境风干RNA沉淀。

用20州DEPC处理的双蒸饰水(ddH20)溶解RNA沉淀,・80 0C备用;取4川总RNA加至200川灭菌水中，在紫外分光光度仪上测定其ODZ}o 和ODZSo,计算 ODZ)o/ODZSoo 样品总 RNA v ug 枢 1) = OD26ox40x 稀释倍数(50 )/1000 o OD26o/ODZgo在1.8-2.0之间为样品较纯2) 反转录反应:在20川反应体积中进行,成分如下:总RNAtug (5 JH),随机引物1 } 1 } DEPC处理的ddH20 4.5} 1) 70 0C冰浴1 Omin;加10林1逆转录反应液(1 Oxbuffer 2) 1MgCL24) 1) dNTP2} 1) inhibitor0.5) 1,逆转录酶 1) 1)} 420C 冰浴 60min } 99 0C 冰浴_5 min■20 0C保存备用3) 引物扩增设计:根据Genebank序列，设计各个引物序列并合成4) 实时定量PCR实验方法:使用宝生物工程(大连)有限公司的SYRB. Premix ExTaqTM和Light Cycler PCR扩增仪(Roche)进行荧光扩增;求出CT值6)激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)测定THP-1细胞内游离钙的变化取6孔板进行THP・1细胞培养，事先在6孔板中加入盖玻片。

取6孔培养板中的 盖玻片，D — Hanks液冲洗2遍，用1OO}L的钙离子探针Fluo-3 /AM与F-127混合工作液(10 ) mol/LFluo-3 /AM, 0.02070 F-127)滴于盖玻片上，370C 避光 40 min } D — Hanks 液再次冲洗 玻片3遍，洗去多余染料,保留少许D-Hanks液平衡细胞10 min,分组施加因素后,于10 min 内利用LSCM进行细胞内Ca2+浓度检测⑺汕红O染色汕红O属于偶氮染料，是很强的脂溶剂和染脂剂，与甘汕三醋结合呈小脂滴状 脂溶性染料能溶于组织和细胞中的脂类，它在脂类中的溶解度比在溶剂中人当组织切 片萱人染液吋，染料则离开染液而溶于组织内的脂质(如脂滴)中，使组织内的脂滴呈橘红 色细胞接种于6孔培养板内，诱导建模结朿后，吸去上清液，M PBS洗三次，冰冻 的4}多聚甲醛固定_5 min, PBS洗一次，再置于丙二醇中固定_5 min,轻轻吸去丙二醇， 加入0. _5%汕红O的丙二醇溶液，H 60C烤箱中染色1 _5 min,用8_5%丙二醇冲洗_5 min, 再用PBS洗三次，蒸馆水清洗1次，苏木索复染2-5 min } 1 07oHCL分色及返蓝后封片。

置显微镜下观察并摄像，细胞内脂质为红色，胞核为蓝色参考文献:Zheng XD, Li Q, Tang XB, Liang SJ, Chen LP, Zhang S, Wang ZQ Guo L, Zhang R、Zhu DL. Source of the elevationCa2+ evoked by I S-HETE in pulmonary arterial myocytes. European Journal of Pharmacology 2(X)&601:16-22⑻细胞内胆•固醇含量的测定细胞内胆固醉的提取:细胞接种于6孔培养板内，培养结束后，吸去上清液，冰预 冷PBS洗三次，用细胞刮刀刮収细胞，加1 mL冰预冷0.9%生理盐水重悬细胞，反复冻 融三次，冰浴中超声破碎_5 min,得细胞裂解液，分装，每份200匹，・700C贮存，用于测 定总服固醇和游离胆固醇总胆固醇的提取:取160)L述细胞裂解液,加300)L 15 } KOH乙醇溶液,_500C 水解2h,加正己烷一异丙醇(4:1)SOO}L}涡漩30 s ) 40C F 3600 r/min离心_5 min,取上 层。

继用正己烷一异丙醉(4:1)如上法抽提两次，合并三次抽提的有机相，减压真空干燥，加 20JL内标储备液，用甲醇并定容至2mL,摇匀，作为总胆固醇供试品溶液游离)固醇的提取:取160)L述细胞裂解液，加300}L乙醇，加正己烷一异丙醇(4:1)500匹涡漩30 s ) 40C卜3600 r/min离心_5 min,取上层继用正己烷一异丙醉(4:1) 如上法抽提两次，合并三次抽提的有机相，减压真空T•燥，加20}L内标储备溶解并定容至2mL,摇匀，作为游离胆」古I醇供试品溶液HPLC测定胆」古I醇:色谱柱:Hypersil C 18柱(2」mmx150 mm) 3}m);流动相:甲 醇一水(90:10);流速:0.5 mL/min;柱温:室温;进样量:10 }Lo参考文献:唐朝克，王佐，易光辉，万载阳，刘录山，袁中华，王燕，危当} 亘,阮长耿,杨永宗.Rolipram对THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞胆固醇流出和ABCA1表达的影响冲国药理学通报.2003 oct; 19( 10): 1177-82(9) ELISA法检测细胞因子的分泌情况按每孔2x1护个细胞接种于24孔板中，含有160nmol/LPMA的培养液培养72小 时后,PBS洗三遍，各组加入处理因素，继续培养24小时。

收集细胞培养上清液从平衡至 室温的密封袋中取出实验所需板条，留空白孔加0.1ml离心后的细胞培养上清液于反应 孔中,S 370C孵育90分钟然后洗板_5次同时做空白孔，标准品空)于各反应 孔中，加入新鲜稀释的生物素化抗体工作液0.1ml) 370C孵育1小吋，洗板_5次加酶结合工作液O.lml) 370C避光孵育30分钟,洗板_5次加入O.lml显色底物液,370C避光孵育 1 _5分钟于各反应孔中加入终}卜液O.lml}混匀厉即可测量ODq5()值10) Western Blot检测蛋白表达变化1) 总蛋白的提取:收集细胞，加入冰预冷的蛋白裂解液(Immol/LPMSF ) pH7.4) 混匀，超声破碎细胞；4 0C ) 12000rpm,离心1 _5min,取上清液，用考马斯亮蓝法染色，测定蛋白含量;取上清加入_5*样缓冲液(体积比4: 1)) 1000C沸水中煮_5 min, -20 0C 备用2 ) SDS-PAGE电泳:按照胶配置方法配制不同浓度PAGE胶，电泳置染料抵达分 离胶底部，断开电源，取下凝胶切下带有要转移蛋白泳道的凝胶，右下角作一•标记 以确定方向及正反而3) 转膜:剪1块与凝胶大小相同的NC膜(不能大于凝胶)，右下角作一•标记，浸 泡于转移缓冲液中，人约_5 min o剪8块滤纸，右下角作一•标记，其人小略与凝胶相同(不能大于凝胶)。

将剪好的滤纸在转移缓冲液中浸泡，按阳极到阴极(从下至上)川页 序安装转移装直:平放底部电极，在底部电极上放直4张浸泡好的滤纸，精确对齐，将 NC膜放在滤纸上，排除气泡把SDS-PAGE电泳凝胶转移到去转移缓冲液中漂洗，平 放于NC膜上，用玻棒挤出所有气泡，在其上再放置4张浸泡好的滤纸，排出气泡将 上层电极放于夹层物上，连接电源，根据凝胶而积按1 mA/cm2接通电源4) 封1}7:转移结束后,在TBS-T液内清洗20min,加_5%脱脂奶粉,37 0C封闭lho _5)--抗孵育:封闭结束后，用TBS-T稀释第一抗体，将NC滤膜宜于其中，4 0C震荡过夜6)显迹:TBS-T液漂洗NC膜3次/I Omin,将膜与TBS-T稀释二抗孵育，室温下 振荡lh; TBS-T漂洗NC膜3次/lOmin; TBS液漂NC月莫3次/I Omin } X光胶片上 曝光，随后显影、定影，用图像分析系统测定蛋白条带的光密度，进行定量分析11) 免疫荧光技术检测蛋白表达定位1) 细胞生长贴在玻片上，细胞密度适中，人约60-7.5%满片即可2) 取出细胞后用4%多聚甲醛固定1 _5分钟，现用现配3) PBS冲洗。

4) 0.107oTriton 作用 20 分钟5) PBS冲洗6) 10%正常血清封闭10分钟7)加入一抗，4度孵育过夜8) PBS冲洗4次，各_5分钟9) 加入荧光二抗，室温30分钟10) PBS冲洗4次,各_5分钟11) 90%H汕封片12) 避光保存，荧光显微镜下观察并照相记录3)关键技术(详见:2)实验手段)⑴CaSR的siRNA的设计及转染平台的建立由于巨噬细胞是终末分化的细胞，转染相对较难siRNA的转染需要注意如下儿点:工纯化siRNA II避免RNA酶污染III避免使用抗生索W通过看家基因作为 阳性对照优化转染和检测条件2) 细胞内游离钙的测定激光共聚焦显微镜用于。