荧光分析法标准操作规程.doc

荧光分析法标准操作规程荧光分析法标准操作规程1 1 简述简述 某些物质受紫外光或可见光照射激发后，它会在极短时间内发射出较照射光波长为长 的光，而当照射光源停止照射时，这种光线也随之消失，这种光称为荧光荧光通常发生 于具有共轭双键体系的分子荧光分光光度法具有灵敏度高、选择性强、试样量少和方法 简便等优点 荧光光谱包括激发光谱和发射光谱，激发光谱是指不同激发波长的光引起物质发射某 一波长荧光的相对效率，即发射波长不变，将激发波长进行扫描发射光谱是指某一激发 波长的光引起物质发射不同波长荧光的相对效率，即激发波长不变，将发射波长进行扫描 物质的激发光谱和荧光发射光谱，可用作定性分析当激发波长、强度、所用溶剂等条件 固定时，物质在较稀的一定浓度范围内其发射光强度与溶液中该物质的浓度成正比关系， 可用作定量分析 荧光强度的测量用下式表示 F=K＇ΦI0（1—e-εbc） 式中 F 是荧光强度，K＇是仪器常数，Φ 是量子效率，I0是激发光强度，ε 是摩尔吸 收系数， b 是样品池光程，c 是样品的浓度 由式可见荧光强度与仪器条件有关，以此供试品必须与对照品在相同条件下测定 2 仪器和用具、溶剂仪器和用具、溶剂 2.1 仪器 荧光分析法所用的仪器为荧光分光光度计或荧光计，它由激发光源、激发 单色器和发射单色器、样品池、检测器及记录仪表组成。

光源：多采用高压氙灯，它在紫外光区和可见光区都能给出连续辐射（220~700nm） 单色光器：由光栅和狭缝组成有两组，一组为激发单色器，光源的连续辐射经激发 单色器得到单色光照射到样品池，供试品溶液经激发光照射后产生的荧光则常以激发光源 呈 900 的角度照射到发射单色器，发射单色器分光以后照到光电倍增管转换为电信号，送 入显示或记录仪表读数或记录 样品池：常用石英池，质地应较纯，不含荧光 杂质，固定受光面标志如拟配对使用， 则可盛稀硫酸奎宁溶液（1×10-8g/ ml） ，激发波长 350nm，发射波长 450nm，调节仪器示 值为 95％，选择各池荧光强度相差不大于 1.0％者成对使用 仪器的使用按各仪器说明书进行操作，通常应在光源点燃及主机预热 20min 后再进行 测定 2.2 仪器的性能检测 荧光分光光度计，各仪器厂商有其自订的技术指标，国家技术 监督局颁布有“JJG537—88 荧光分光光度计试行检定规程” ，对其技术性能有多项具体规 定 2.2.1 波长准确性 可将发射单色器置零级位置，在灯室内安放笔形汞灯，并将漫反 射板校正具放入样品室，选择分布均匀的 5 条谱线作参考波长，记录其最大读数时的波长 为测量值，与已知波长值进行比较，或用氙灯的 450.1nm 谱线检查，其波长准确性应符合 技术指标所规定。

2.2.2 灵敏度（信噪比 S/N）采用水的拉曼谱线测定，可置激发波长为 350nm，激发 和发射单色器狭缝为 10nm,用二次蒸馏水，调节灵敏度使发射波长为 397nm 时仪器示值在 40％左右，发射波长退回到 300nm,调仪器零位，扫描发射波长，记录 300~430nm 发射光 谱曲线，发射光谱 397nm 附近的峰值即为 S,然后在峰值处记录 2min，记录噪声曲线最大 的峰—值即为 N 灵敏度应符合其技术指标其他技术指标如分辨率、线性误差、稳定度等，可参照 JJG537—88 检查规程 2.3 用具与溶剂 玻璃仪器：荧光法因灵敏度高，影响因素也多所用的玻璃仪器与测定池，必须保持高 度洁净应无荧光物质污染 蒸馏水：要用双重蒸馏水 溶剂：要用较高纯度，必要时应预处理以消除其中存在微量荧光物质或可致降低荧光 强度的成分如溶剂的干扰在欲测波段及测定条件影响可以忽略，也可只用简单的处理或 事先作空白对照试验 3 操作方法和注意事项操作方法和注意事项 按各品种项下的规定，选定激发光波长和发射光波长，并配制对照溶液和供试品溶液， 按仪器说明进行操作，通常选用四面透光、无荧光的 1cm×1cm 石英小池进行测定。

3.1 配制好溶液，转移到荧光分光光度计用的石英池中，按各品种规定用单色波长的 激发光束进行照射，在荧光的规定波长处理其发射光的强度 3.2 定量测定时，由于不易测定绝对荧光强度，故常见的分析方法都是在一定的条件 下，用对照品溶液测得浓度的线性范围后，按以下步骤测定 3.2.1 以配制供试品溶液的溶剂作空白，调节零点 3.2.2 按规定取标准溶液或最浓的 1 份对照品溶液，测定荧光强度，调节仪器的灵敏 度使荧光强度接近最大 3.2.3 读取对照品溶液及其试剂空白与供试品溶液及其试剂空白的读数，按计算公式 得出供试品的浓度供试品级对照品应各取 2 份，平行操作 3.2.4 有些易被光分解或弛豫时间较长的品种，为使仪器灵敏度定标准确，应避免激 发光过度照射，即适当采用较小的入射狭缝，并尽可能缩短激发光照射供试液的时间必 要时可选择一种激发光和发射光波长与之近似而对光稳定的物质配成适当浓度的溶液，作 为基准溶液，例如蓝色荧光可用硫酸奎宁的稀硫酸溶液，黄绿色荧光可用荧光素钠水溶液， 红色荧光可用罗丹明 B 水溶液等先与对照品溶液比较测定其读数关系，并在测定供试品 溶液时，用以代替对照品溶液以校定仪器的灵敏度。

通常可将此种物质溶液荧光强度调整 读数为 100 3.3 注意事项 3.3.1 溶剂及所用玻璃器皿，应高度纯净，操作中注意防止荧光污染 3.3.2 荧光仪器上所用的石英样品池质量较好，应不含荧光性杂质，不可与其他仪器 混用，使用前后，注意清洗，保持洁净 3.3.3 荧光仪器在测定时打开光照闸门，读数以后应立即关闭光路，因样品溶液的较 长时间光照，将使荧光效率降低，受光检测器光电管也易疲劳老化 3.3.4 供试品溶液的浓度，药典品种正文上虽已有注明，但荧光仪器由于各厂牌型号 灵敏度的差异，可能不一定完全合适，必要时可经试验，找出合适的供试品溶液浓度并确 定仪器测试条件 3.3.5 如对某些新品种供试品激发及发射波长未知时可按仪器规定的方法先行预设某 一激发波长（如 250nm） ，扫描记录发射光谱，找出发射光谱最大波长后再扫描记录激发光 谱，从而选出供试品合适的激发光与发射光波长 3.3.6 采用由稀到浓几个不同浓度的供试品溶液，进行荧光强度测定，找出其线性浓 度范围 3.3.7 温度对荧光强度有较大影响，测定时应控制温度一致 3.3.8 溶液中溶解氧有降低的作用，必要时可在测定前通入惰性气体以除去氧。

3.3.9 测定时需注意溶液的 pH 值和试剂的纯度对荧光强度的影响4 计算计算 供试品溶液的浓度以下进行计算Rx—Rxb Cx=—————×Cr Rr—Rrb 式中 Cx为供试品溶液的浓度； Cr为对照品溶液的浓度；Rx为供试品溶液的荧光强度； Rxb为供试品溶液试剂空白的荧光强度； Rr为对照品溶液的荧光强度； Rrb为对照品溶液试剂空白的荧光强度因荧光分析法的浓度与读数的线性范围较窄，故比值（Rx —Rrb）/(Rr—Rrb)应控制在 0.5~2.0 之内，如有超过，应在调节溶液浓度后再测，如线性关系不好应改用工作曲线法5 结果的判定荧光分析法一般用于样品的含量、溶出度、含量均匀度等的测定，根据上述计算公式， 得到公式品溶液的浓度，判断样品的合格范围2 份供试品测定结果，每份结果对平均值的偏差应在±1.5％以内，否则应重做。