用原子力显微镜表征DNA纯化效果的实验研究.doc

1用原子力显微镜表征 DNA 纯化效果的实验研究作者：熊洁，陈宝安，巴龙，高峰，高冲，丁家华，孙耘玉，程坚，王骏，赵刚，杜鹃，陆祖宏 ［摘要］目的：运用原子力显微镜(AFM)表征 3 种 DNA 纯化试剂盒对 DNA 的纯化效果方法：PCR 扩增 K562/A02 细胞 mdr1 基因DNA,分别以 3 种不同的 DNA 纯化试剂盒对ＰＣＲ产物进行纯化后，按终浓度为 10 ngμl-1 固定在用 1 ngμl-1 L型多聚赖氨酸预先处理过的新剥离的云母片上，用 AFM 获取 DNA扫描图像，分析评价 3 种 DNA 试剂盒对 DNA 的纯化效果结果:用 AFM 成功表征 3 种纯化试剂盒纯化后 DNA 片段，获得了清晰的DNA 图像对 3 种 DNA 纯化试剂盒的纯化效果作出评价，建议其中的两种 DNA 纯化试剂盒的 DNA 纯化产物可用于 AFM 的 DNA 分析结论：用 AFM 表征 DNA 时对 DNA 的纯度要求较高通过对 3 种 DNA 纯化试剂盒纯化效果的比较，为 AFM 观测 DNA 样本的纯化方法提供了较好的方案［关键词］原子力显微镜;表征;脱氧核糖核酸;纯化2Abstract：Objective To identificate purification effect of three kinds of DNA purification kits by atomic force microscopy(AFM).Methods Cultivateion and PCR technique was used to amplify K562/A02 cells with DNA of mdr1gene. The amplified products were purified by three kinds of DNA purification kits， a final concentration of 10 ngμl -1 DNA samples were placed on a freshly cleaved mica treated by 1ngμl -1 Lpolylysine.AFM was used for the imaging of the three pieces of DNA samples.Results Through AFM image analyzing, the purification effect of three kinds of DNA purification kits was evaluated, two kits can be used to purify DNA samples for AFM imaging. Conclusion The higher the purify of DNA sample used, the better the AFM image got. Two better purification schemes have been achieved for DNA imaging using AFM through comparing three kinds of DNA purification kits.Key words：atomic force microscope ; identification；deoxyribonucleic acid; purification 原子力显微镜（atomic force microscope，AFM ）是具有原子级分辨率的新一代显微镜，因其能够对 DNA、蛋白质、磷脂生3物膜、多糖等生物大分子以及有机化合物的形态及功能进行观察研究而引起了人们的广泛关注［1］ 。

近十几年，运用 AFM 在固相载体表面研究 DNA 分子技术取得的巨大进步, 大大地增进了人们在分子层面上对 DNA 分子的了解［25］ AFM 在样本制备上相对较容易，但用于 DNA 研究时，要想得到质量较高的 DNA 图像对 DNA样品的纯度要求较高我们选择了 3 种不同的 DNA 纯化试剂盒对K562/A02 细胞株 mdr1 基因 769bp DNA 的 PCR 产物进行纯化后在相同条件下用 AFM 观测，通过比较，建议其中的两种可用于AFM 的 DNA 样品的纯化1 材料和方法1.1 细胞培养K562/A02 细胞株由中国医学科学院血液学研究所杨纯正、齐静老师惠赠细胞接种于含 10%小牛血清的 RPMI 1640(Gibco/BRL 公司产品)培养液，置于 37℃、5%CO2 培养箱中常规培养，2~3d 传代 1 次，实验前无药培养两周1.2 DNA 提取取对数生长期、终浓度 2×105ml-1 的 K562/A02 细胞43ml，以酚/氯仿法抽 DNA 后，加 100μl TE 缓冲液于-20℃保存用紫外分光光度计定量，要求 A260/A280≥1.81.3 PCR 扩增从基因库中查得所需 mdr1 的基因序列号，引物根据基因库提供的基因全序列用计算机软件 Primer3 设计，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，引物序列：上游5′ATACTTTACTCCTTCCTTCAA3′，下游5′TCTGAATAAAGTAGATTTCTTCATG3′,扩增 K562/A02 细胞mdr1 基因-758 ～＋11 的 DNA,片段长度为 769bp。

PCR 反应体系：纯化的 DNA 模板 2.5μ1，50pmolL-1 上下游引物各1μ1，25mmolL-1 MgCl2 1.5μ1， dNTP4μ1，5×PrimeStaRTM 缓冲液(含 Mg2＋)10μ1，10mmolL-1 PrimeStaR HS DNA 聚合酶 0.5U,余用灭菌去离子水补至 50μ1热循环参数为： 98℃ 变性10s，55℃退火 10s，72℃延伸 1min;扩增 30 个循环1.4 10gL-1 琼脂糖凝胶电泳取 10μl PCR 产物，加 2μl 溴酚蓝上样缓冲液，加入 3 个点样孔行 1.0%琼脂糖凝胶电泳，在 TAE 电泳缓冲液中，电压55Vcm-1,45min 后取出凝胶置于紫外透射仪上显影拍照1.5 DNA 纯化在紫外特摄仪下切取 3 条含有清晰目的ＤＮＡ条带的凝胶块，分别用琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒（DP2092，TIANWEI 公司产品） 、DNA 小量胶回收试剂盒（W5211,2408A,Waston 公司产品）及琼脂糖凝胶 DNA 纯化试剂盒（DV805A,TaKaRa 公司产品）按相关说明书进行纯化，纯化样品于-20℃保存1.6 样本的制备按 Tanigawa 等［ 6］的方法用 1ngμl-1 L 型多聚赖氨酸(Sigma 公司产品)预先处理新剥离的云母片(1.0cm×1.0cm)。

多聚赖氨酸处理过的云母片用双面胶带粘附于甩膜机上，分别滴加以 3 种 DNA 纯化试剂盒纯化后，终浓度为 10ngμl-1 的K562/A02 细胞 mdr1 DNA 样品 20μl 于云母片中央，并在室温下作用 2min, 用 7000rmin-1 离心, 用吸量管吸 1000μl 去离子水滴加在旋转的云母片中央，冲洗 3 遍，时间持续 1min，制备成 3 份 DNA 观测样品61.7 AFM 观察和分析样品使用 Nanoscope AFM (Veeco/Digital Instruments, Santa Barbara, CA)观测, 在 tapping 模式下操作，像素密度为512×512，操作条件是室温、空气中，相对湿度不超过 37%用125μm 硅针尖 tapping 模式下共振频率为 300~400kHz、针尖扫描频率为 1~2Hz 进行扫描获取扫描图像后，用 Veeco/Digital Instruments 公司的程序软件将图像进行去噪声处理，获得清晰的DNA 图像通过图像分析，评价 3 种试剂盒对 DNA 的纯化效果 2 结果2.1 获取 DNA 样品用 PCR 的方法扩增 K562/A02 细胞 mdr1 基因 769bp 的DNA 片段，琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 扩增产物（图 1） ，切取 3 条清晰条带后分别用 3 种不同的 DNA 纯化试剂盒严格按相关说明书进行纯化，纯化样品于-20℃保存。

1~3.K562/A02；4.DNA Marker 图 1 琼脂糖凝胶电泳检测 K562/A02 mdr1 基因 DNA 的PCR 产物（略）7Fig 1 Agarose gel electrophoresis of PCR amplified products of K562/A02 cells mdr1 gene2.2 通过 AFM 图像观测 DNA 评价 3 种不同 DNA 纯化试剂盒的纯化效果通过 AFM 获取了 3 份不同纯化试剂盒纯化后 DNA 的清晰、分散图像（图 2、3、4） ，所得的图像显示以上述方法制备的 DNA样本均能达到较好的线性化，说明我们的样本制备是成功的在DNA 样本来源、样本制备方法、操作模式及观测条件均相同的情况下，并排除了云母表面吸附力大小、 DNA 浓度及灰尘等对样品分散的影响，我们通过图像观察发现，经 TIANWEI 公司的琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒纯化后的 DNA 样本（如图 2）中含有较多的大小不均的颗粒杂质，制片背景不清晰，有少量颗粒粘附于 DNA 上，可能会影响对 DNA 的轮廓观察及模数分析，因此我们推断该种试剂盒的 DNA 纯化产物不能达到 AFM 对 DNA 观测要求。

经Waston 公司的 DNA 小量胶回收试剂盒纯化后的 DNA 样本（如图3）及 TaKaRa 公司的琼脂糖凝胶 DNA 纯化试剂盒纯化后的 DNA样本（如图 4）制片背景清晰，所含的杂质成份较少，DNA 轮廓清晰，能够较为准确地反映 DNA 的真实构象，我们认为这两种试剂盒的 DNA 纯化产物符合 AFM 对 DNA 观测标准，可用于 AFM 观测 DNA 样本的纯化8图 2 用 TIANWEI 公司的琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒纯化后 DNA 的 AFM 图像（略）Fig 2 AFM iamge of target DNA purified by DNA isolation kit(TIANWEI Co.,Ltd.)图 3 用 Waston 公司的 DNA 小量胶回收试剂盒纯化后DNA 的 AFM 图像（略）Fig 3 AFM iamge of target DNA purified by DNA isolation & purification kit(Waston Co.,Ltd.)图 4 用 TaKaRa 公司的琼脂糖凝胶 DNA 纯化试剂盒纯化后DNA 的 AFM 图像（略）Fig 4 AFM iamge of target DNA purified by agarosegel DNA purification kit(TaKaRa Co.,Ltd.)3 讨论AFM 具有非常高的横向和纵向分辨率,其横向分辨率可达0.1～0.2nm，纵向分辨率高达 0.01nm， 可以得到纳米级的、清晰的生物样品三维结构图像［7］ ，加之其具有很宽的工作范围，近几年在生物医学研究中得到了广泛应用。

9AFM 可以清晰观察到体外生理状态下各种 DNA 分子的三维结构，并可以测算出分子的宽度和高度，尤其对高度可以精确地测算［8］ 用 AFM 对 DNA 进行观测时，采用高质量的 DNA 样品可以得到较为真实可靠的测量结果，从而保证 DNA 形态研究的准确性，因此对 DNA 样本的纯化和制备过程要求较高我们的试验结果显示，用 AFM 表征的 3 份 DNA 样品均呈现清晰、分散的 DNA结构图像，表现出较好线性化，无盘结缠绕，说明我们的样本制备是成功的在相同试验条件及。