分子生物学实验原理.ppt

分子生物学实验原理分子生物学实验原理第一节 分子生物学发展概述分子生物学发展概述l分子生物学分子生物学molecular biology是在分子水平上是在分子水平上研究生物的结构、组织和功能的科学研究生物的结构、组织和功能的科学l1950年，年，Astbury在一次学术报告中，首在一次学术报告中，首次提出并使用了分子生物学这一名词术语次提出并使用了分子生物学这一名词术语l广义和狭义之分广义和狭义之分l医学分子生物学医学分子生物学是应用分子生物学技术和是应用分子生物学技术和理论来阐明人体正常生理活动和病理过程及理论来阐明人体正常生理活动和病理过程及其调控的分子机理其调控的分子机理分子生物学理论与实际应用的成就分子生物学理论与实际应用的成就理论方面理论方面1.关于肿瘤的发生：关于肿瘤的发生： 提出了肿瘤起源于提出了肿瘤起源于细胞增细胞增殖和分化调控的失常殖和分化调控的失常和细胞同它周围组织关系和细胞同它周围组织关系的紊乱• 癌基因：癌基因：100多种；抑癌基因：多种；抑癌基因：20多种多种• 细胞周期调控系统细胞周期调控系统• 细胞凋亡细胞凋亡• 端粒酶端粒酶2.关于艾滋病关于艾滋病 Acquired Immune Deficiency Syndrome HIV序列；疫苗序列；疫苗3.关于慢性病关于慢性病chronic disease，如心血管疾，如心血管疾病、肥胖、糖尿病、骨质疏松，发现了病、肥胖、糖尿病、骨质疏松，发现了相关基因及其多态性。

相关基因及其多态性4.关于生长、发育与进化的统一理论，关于生长、发育与进化的统一理论，也深入到了分子水平也深入到了分子水平实际应用方面实际应用方面1.转基因植物转基因植物目前已鉴定和克隆化的用于转基因植目前已鉴定和克隆化的用于转基因植物的物的基因有基因有100多个多个抗除草剂、抗昆虫、抗病毒、抗不良抗除草剂、抗昆虫、抗病毒、抗不良环境因素环境因素（抗寒、抗盐碱地、抗旱、（抗寒、抗盐碱地、抗旱、抗涝）、提高作物的产量、抗涝）、提高作物的产量、提高蛋白提高蛋白质含量质含量、改善氨基酸构成等改善氨基酸构成等2.转基因动物转基因动物 1983年，年，超级小白鼠超级小白鼠，体重是正常鼠的，体重是正常鼠的2倍随后出现转基因倍随后出现转基因猪、羊、鸡、兔、牛、猪、羊、鸡、兔、牛、鲤鱼鲤鱼等我国目前研究了金鱼、鲤鱼、圆等我国目前研究了金鱼、鲤鱼、圆头鲂3.基因工程多肽药物与疫苗基因工程多肽药物与疫苗 主要指主要指DNADNA体外重组技术所研制的产品，体外重组技术所研制的产品，转基因动物和植物所研制的产品转基因动物和植物所研制的产品，以及，以及蛋蛋白质工程技术白质工程技术所研制或改进的产品。

所研制或改进的产品 4.基因诊断与基因治疗基因诊断与基因治疗 基因诊断基因诊断gene diagnosis是指通过直接探查基是指通过直接探查基因的存在状态或缺陷，从而对疾病作出诊断因的存在状态或缺陷，从而对疾病作出诊断的方法 目的物：目的物：DNA或或RNA 方法：方法：核酸分子杂交技术、核酸分子杂交技术、PCR技术、技术、 DNA芯片技术芯片技术 疾病：疾病：遗传性疾病；传染病或感染性疾病遗传性疾病；传染病或感染性疾病基因治疗基因治疗gene therapy 指将正常的外源基因导入生物体靶细胞内，指将正常的外源基因导入生物体靶细胞内，以弥补所缺失的基因，关闭或降低异常表以弥补所缺失的基因，关闭或降低异常表达的基因，以达到治疗疾病的目的达的基因，以达到治疗疾病的目的治疗疾病：治疗疾病： 遗传病遗传病 恶性肿瘤恶性肿瘤 传染病传染病5.环境监测与净化环境监测与净化 area survey and depollution 监测：可检测环境中的监测：可检测环境中的病毒和细菌病毒和细菌 净化：改造细菌净化：改造细菌分解环境中的石油、残留的农药分解环境中的石油、残留的农药和有毒金属和有毒金属6.克隆动物克隆动物Clone animal 1997年年“多利多利”克隆羊克隆羊 克隆器官克隆器官（干细胞（干细胞stem cell技术）技术）7.人类基因组计划人类基因组计划human genome project;HGP1990年，年，美国国立卫生研究院（美国国立卫生研究院（NIH）） 和美国和美国能源部能源部联合发表了人类基因组计划。

联合发表了人类基因组计划30亿个碱基对亿个碱基对，估计有，估计有3万～万～4万个人类基因万个人类基因2000年年6月月26日，首次绘成人类基因组日，首次绘成人类基因组“工作工作框架图框架图” 2003年年4月月14日，中、美、日、德、法、英等日，中、美、日、德、法、英等6国科学家及领导人宣布人类基因组序列图绘制国科学家及领导人宣布人类基因组序列图绘制成功，成功，人类基因组计划的所有目标全部实现人类基因组计划的所有目标全部实现  意意 义义与与“阿波罗阿波罗”登月计划相媲美登月计划相媲美1996年诺贝尔化学奖得主罗伯特年诺贝尔化学奖得主罗伯特·柯特认柯特认为，为，20世纪是物理学和化学的世纪，世纪是物理学和化学的世纪，21世世纪将是生物学的世纪纪将是生物学的世纪推动分子生物学更加快速地发展：推动分子生物学更加快速地发展：蛋白质蛋白质组学、代谢蛋白质组学、药物蛋白质组学、组学、代谢蛋白质组学、药物蛋白质组学、毒物蛋白质组学、营养蛋白质组学毒物蛋白质组学、营养蛋白质组学及各种及各种计划计划对对其他相关学科的影响其他相关学科的影响1.向其他学科渗透向其他学科渗透2.形成了许多新兴的边缘学科形成了许多新兴的边缘学科 基础医学方面基础医学方面：肿瘤分子生物学、免疫分子生：肿瘤分子生物学、免疫分子生 物学、神经分子生物学等物学、神经分子生物学等 预防医学方面预防医学方面：分子营养学、分子毒理学、分：分子营养学、分子毒理学、分 子流行病学、遗传流行病学、人子流行病学、遗传流行病学、人 类基因组流行病学、类基因组流行病学、 公共卫生公共卫生 遗传学遗传学在预防医学中的应用及发展方向在预防医学中的应用及发展方向1.1.慢性病的研究慢性病的研究 慢性病的发病原因绝慢性病的发病原因绝大多数是大多数是基因与外界环境因素相互作用基因与外界环境因素相互作用的结果的结果。

2.环境因素对人类遗传物质损伤的研究及环境因素对人类遗传物质损伤的研究及“三致三致”毒性的研究：毒性的研究：生物标志物的研生物标志物的研究和评价方法的建立究和评价方法的建立3.环境监测与污染物的净化环境监测与污染物的净化4.4.遗传病的产前诊断（基因型预防）及早期诊遗传病的产前诊断（基因型预防）及早期诊断（表型预防）断（表型预防）5.5.某些重要疾病的生物工程疫苗的研制某些重要疾病的生物工程疫苗的研制 6.6.对环境因素敏感基因及易感人群的研究环境对环境因素敏感基因及易感人群的研究环境基因组计划（环境基因组学）基因组计划（环境基因组学） （（1 1）环境应答反应基因）环境应答反应基因 （（2 2）筛选多态性及易感性）筛选多态性及易感性 （（3 3）根据易感性制定不同的干预计划）根据易感性制定不同的干预计划一、分子生物学一些重要的理论知识一、分子生物学一些重要的理论知识1.分子生物学发展史上一些重要的事件分子生物学发展史上一些重要的事件（（1））1865年，年，“遗传学之父遗传学之父”G.Mendel根据根据豌豆杂交试验结果，豌豆杂交试验结果，创立了遗传因子学说创立了遗传因子学说，即，即遗传的分离律和自由组合律。

遗传的分离律和自由组合律2））1903年年W.Sutton提出提出染色体染色体是是Mendel遗遗传单位的载体的概念传单位的载体的概念3））1909年，年，W.Johannsen将这种在染色体将这种在染色体上的遗传单位上的遗传单位定名为基因定名为基因（（gene）（（4））1910年，现代实验遗传学奠基人年，现代实验遗传学奠基人TH.Morgan和他的研究生在研究果蝇的遗和他的研究生在研究果蝇的遗传规律时发现了传规律时发现了基因的连锁律和交换律基因的连锁律和交换律5））1944年，年，OT.Avery等人（等人（3人）分离人）分离出细菌出细菌 DNA，，并发现并发现DNA是携带生命遗传是携带生命遗传物质的分子物质的分子6））1950年，年，Astbury在在一次演讲中，首次一次演讲中，首次使用了使用了 “分子生物学分子生物学” 术语术语7））1953年，年，Watson和和Crick提出了提出了DNA结构的结构的双螺旋模型双螺旋模型，揭示了遗传物质自我复，揭示了遗传物质自我复制的机制制的机制（（8））1961年至年至1966年，年，Nirenberg和和Crick 等人破译了等人破译了DNA遗传密码遗传密码，，1966年年 破译了破译了64个遗传密码。

个遗传密码 提出了遗传信息由提出了遗传信息由DNA → RNA→蛋白蛋白质传递的质传递的中心法则中心法则 （（9））1969年，年，Jonathan Beckwith及其同及其同事在哈佛大学成功事在哈佛大学成功分离出第一个基因分离出第一个基因10））1970年，发现了年，发现了逆转录酶逆转录酶11））1961年，年，F.Jacob和和J.Monod提出了提出了乳糖操纵子学说乳糖操纵子学说（（12）自）自1946年起的年起的20年当中，陆续发现年当中，陆续发现了许多了许多质粒质粒；；1968年至年至1970年又发现了许年又发现了许多多限制性内切酶限制性内切酶，为，为DNA体外重组提供了体外重组提供了有利工具有利工具13））1973年，年，重组重组DNA技术问世技术问世14））1986年，年，K.Mullis等建立了等建立了PCR技术技术（（15））1990年，年，人类基因组计划人类基因组计划 2.2.三个重要理论三个重要理论important theory(1)DNA(1)DNA的结构、复制、中心法则的结构、复制、中心法则Ø基本构成单位是基本构成单位是核苷酸核苷酸Ø核苷酸由核苷酸由脱氧核糖、碱基和磷酸脱氧核糖、碱基和磷酸构成。

构成Ø碱基分别是碱基分别是腺嘌呤腺嘌呤 (A)(A)、、鸟嘌呤鸟嘌呤 (G)(G)、、胸胸腺嘧啶腺嘧啶 (T)(T)和胞嘧啶和胞嘧啶(C)(C)Ø相邻的两个核苷酸以相邻的两个核苷酸以磷酸二酯键磷酸二酯键相连相连Ø进一步盘旋、折叠，形成进一步盘旋、折叠，形成三级或四级结构三级或四级结构RNARNA与与DNADNA有如下不同点有如下不同点：：u五碳糖为五碳糖为核糖核糖( (不是脱氧核糖不是脱氧核糖) )；；u碱基中有碱基中有尿嘧啶尿嘧啶U(uracilU(uracil) )而而没有胸腺嘧没有胸腺嘧啶啶uRNARNA为为单链单链，不是双链，但，不是双链，但RNARNA单链之间单链之间相邻的碱基可由氢键作用形成局部双链相邻的碱基可由氢键作用形成局部双链 uDNADNA存在于细胞核的染色体、线粒体存在于细胞核的染色体、线粒体以及以及染色体以外的质粒中染色体以外的质粒中( (质粒是一些双链，闭质粒是一些双链，闭环的环的DNADNA分子分子) ) DNA(DNA(或或RNA) RNA) 结构给我们的启示结构给我们的启示 ①①DNA(DNA(或或RNA)RNA)是是水溶性的水溶性的。

这是由于含有这是由于含有磷酸基因、羟基和氨基在核酸提取过程磷酸基因、羟基和氨基在核酸提取过程中，我们中，我们保留的是水相、而不是有机相保留的是水相、而不是有机相②②核酸是核酸是两性电离两性电离，既带正电荷，又带负，既带正电荷，又带负电荷它的等电点电荷它的等电点(PI)(PI)为为2 2～～2.52.5在中性溶液中带负电荷对核酸进行溶液中带负电荷对核酸进行电泳时，点电泳时，点样时应点在负极样时应点在负极；杂交时选择尼龙膜时，；杂交时选择尼龙膜时，最好最好选择带正电荷的尼龙膜选择带正电荷的尼龙膜 (核酸带负电荷，核酸带负电荷，容易吸附到带正电荷的膜上，牢固，不掉容易吸附到带正电荷的膜上，牢固，不掉) ) ③③DNADNA在细胞中存在部位不同在细胞中存在部位不同( (细胞核、线粒细胞核、线粒体、质粒体、质粒) )，所以应注意提取方法的不同，所以应注意提取方法的不同 ④④由于由于DNADNA空间构象不同空间构象不同，在电泳时迁移率，在电泳时迁移率不同⑤⑤根据根据碱基互补配对原则碱基互补配对原则，可设计引物和探，可设计引物和探针杂交⑥⑥由于由于DNADNA的双螺旋结构和的双螺旋结构和RNARNA易易由于分子内由于分子内氢链作用形成二级结构，所以在进行杂交等氢链作用形成二级结构，所以在进行杂交等反应时，首先反应时，首先应加热变性，破坏二级结构。

应加热变性，破坏二级结构l 在在解旋酶解旋酶的作用下，打开的作用下，打开DNADNA双链双链 l 在特定的在特定的复制起始点复制起始点l 以每条以每条DNADNA链为链为模板模板l 在在DNADNA聚合酶聚合酶的催化下的催化下l 以以4 4种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸为前体物，合成为前体物，合成一条互补一条互补DNADNA链DNADNA的复制双称为半保留复制的复制双称为半保留复制DNA的复制的复制DNA 半半 保保 留留 复复 制制DNA在复制起始点，由解旋酶打开双链，在复制起始点，由解旋酶打开双链，形成复制叉，形成复制叉，合成新链的合成新链的方向为方向为5’-3’5’-3’端端前导链与后随链前导链与后随链后随链的合成是不连续的后随链的合成是不连续的• 先合成先合成RNARNA引物引物• 再合成不连续的小片段再合成不连续的小片段( (冈崎片段冈崎片段，，100100～～10001000核苷酸长度核苷酸长度) )• 最后在最后在DNADNA连接酶连接酶作用下，将小片段连作用下，将小片段连接起，形成完整的接起，形成完整的DNADNA链 DNA 半半 不不 连连 续续 复复 制制DNADNA的复制给了我们一些启示的复制给了我们一些启示① ① PCRPCR技术的原理：在体外要靠温度技术的原理：在体外要靠温度(90℃(90℃以上以上) )打双链，而不是解旋酶，也是以打双链，而不是解旋酶，也是以DNADNA为为模，需要引物，需模，需要引物，需DNADNA聚合酶，需要聚合酶，需要dNTPdNTP为为前体。

前体PCRPCR与体内与体内( (细胞内细胞内)DNA)DNA复制的最大差复制的最大差异是温度异是温度②②检测核分裂指数：在细胞培养中，检测核分裂指数：在细胞培养中，加入加入3 3H H标记的标记的dNTPdNTP前体物前体物，被细胞摄取后，参与，被细胞摄取后，参与DNADNA复制，复制速度越快，参入的复制，复制速度越快，参入的3 3H H标记的标记的dNTPdNTP越多，可用液闪计数仪检测放射性强度，越多，可用液闪计数仪检测放射性强度，据此判断据此判断p遗传信息的传递是：遗传信息的传递是： DNA→RNA→DNA→RNA→多肽多肽( (蛋白质蛋白质) )p在逆转录酶的作用下，在逆转录酶的作用下，RNARNA可形成可形成cDNAcDNA，，然后再由然后再由RNA→RNA→蛋白质蛋白质以上就是完整的中心法则理论，亦可称以上就是完整的中心法则理论，亦可称为基因的表达为基因的表达(expression)(expression)中心法则中心法则中中 心心 法法 则则 转录转录(transcription)(transcription) 以以DNADNA为为模板，合成模板，合成RNARNA的过程。

的过程 非模板链称为有意义链，而模板常称为反义链非模板链称为有意义链，而模板常称为反义链 转录的过程大致是这样的：转录的过程大致是这样的：u 以以DNADNA一条链为一条链为模板模板，，u 诱导诱导RNARNA聚合酶活性、聚合酶活性、RNARNA聚合酶识别聚合酶识别并结合在并结合在转录起始位点转录起始位点u 以以ATPATP、、GTPGTP、、CTPCTP和和UTPUTP为前体，为前体，合成合成( (转录转录)RNA)RNAu 当遇到转录当遇到转录终止信号时，转录即停止终止信号时，转录即停止有意义链有意义链反义链反义链ü转录后的初级产物转录后的初级产物剪切掉内含子剪切掉内含子，并将外显，并将外显子连接起来，这样才能变成成熟的子连接起来，这样才能变成成熟的RNARNA分子分子ü还需要在还需要在5’-5’-端加一个特殊的核苷酸，端加一个特殊的核苷酸，7-7-甲甲基鸟嘌呤核苷酸基鸟嘌呤核苷酸，这个过程叫戴帽，这个过程叫戴帽ü另外，另外，mRNAmRNA的，这一过程又叫穿靴，的，这一过程又叫穿靴， 3’-3’-端还要加上一串腺苷酸端还要加上一串腺苷酸( (AMP)poly(AAMP)poly(A) )或多聚腺或多聚腺苷酸化。

苷酸化ü同一机体不同的细胞具有相同的同一机体不同的细胞具有相同的DNADNA或基因，或基因，但但基因在不同细胞的表达是不同的基因在不同细胞的表达是不同的，具有组织，具有组织特异性，使不同的细胞具有不同的功能特异性，使不同的细胞具有不同的功能ü由由RNA →RNA →蛋白质的过程，又叫翻译蛋白质的过程，又叫翻译只有聚合只有聚合酶酶IIII催化的反应产物是催化的反应产物是mRNAmRNA，，而只有而只有mRNAmRNA才翻译才翻译成蛋白质成蛋白质ü基因基因(DNA)(DNA)上三个相邻的碱基组成一个密码子上三个相邻的碱基组成一个密码子，，一个密码子决定一种特定的氨基酸，共有一个密码子决定一种特定的氨基酸，共有4 43 3=64=64个个密码子ü在转录过程中，基因上的三联密码子转录成在转录过程中，基因上的三联密码子转录成mRNAmRNA上的三联密码子上的三联密码子ümRNAmRNA由核内转移至细胞浆中的核糖体上，以由核内转移至细胞浆中的核糖体上，以三三联密码子指导合成蛋白质联密码子指导合成蛋白质ü翻译后的翻译后的蛋白质需要加工修饰蛋白质需要加工修饰 中心法则给了我们一些启示：中心法则给了我们一些启示：①①遗传信息由遗传信息由DNADNA上的基因决定。

上的基因决定一旦基一旦基因发生突变因发生突变，将最终导致所翻译的蛋白质，将最终导致所翻译的蛋白质发生改变，从而导致生理功能改变，甚至发生改变，从而导致生理功能改变，甚至出现疾病，如癌症、肥胖等出现疾病，如癌症、肥胖等② ② mRNAmRNA更能准确简便地反映更能准确简便地反映DNADNA上基因所上基因所携带的遗传信息携带的遗传信息因此对基因序列的分析，因此对基因序列的分析，常分析常分析mRNAmRNA的序列即可的序列即可 ③③基因的表达有组织特异性基因的表达有组织特异性，且受许多因，且受许多因素的影响，使素的影响，使mRNAmRNA的表达增强、降低甚至的表达增强、降低甚至关闭，从而影响机体正常生理功能，甚至关闭，从而影响机体正常生理功能，甚至出现疾病出现疾病因此因此常需要检测常需要检测mRNAmRNA的表达的丰度的表达的丰度( (含量含量) )，常用方法有，常用方法有NorthernblotNorthernblot、、RT-PCRRT-PCR定定量量(Real time)PCR(Real time)PCR等这里需要特别强调：在检测这里需要特别强调：在检测mRNA(mRNA(或蛋白或蛋白) )表达时，表达时，一定要先弄清该基因在某种组织一定要先弄清该基因在某种组织中是否有表达中是否有表达。

 ④④根据中心法则，可以根据中心法则，可以RNARNA为模板，在逆为模板，在逆转录酶作用下形成转录酶作用下形成cDNAcDNA，，于是建立了于是建立了RT-RT-PCRPCR的方法的方法 ⑤⑤根据根据mRNAmRNA的的3’3’端有端有poly(A)poly(A)的特点，在的特点，在进行进行反转录时反转录时，就以，就以poly(A)poly(A)为模板设计为模板设计了引物并且了引物并且纯化纯化mRNAmRNA的方法的方法，也是根据，也是根据poly(A)poly(A)的原理设计的的原理设计的⑥⑥根据最后的翻译蛋白质去向的不同，建根据最后的翻译蛋白质去向的不同，建立立不同的蛋白质提取方法不同的蛋白质提取方法，如粒体，，如粒体，在细胞核、在细胞浆、分泌到血液中在细胞核、在细胞浆、分泌到血液中 （2 2）基因表达调控）基因表达调控 以乳糖操纵子学说为例以乳糖操纵子学说为例 乳糖操纵子的基本组成元件乳糖操纵子的基本组成元件 调节调节基因基因 结构基因结构基因 I I P P O O Ⅰ Ⅰ ⅡⅡ ⅢⅢ抑制基因抑制基因(I) ：是阻遏物编码区：是阻遏物编码区启动基因启动基因(P) (P) ：：有有cAMPcAMP受体蛋白受体蛋白(CRP) (CRP) 和和RNARNA聚合酶的结合位点聚合酶的结合位点操纵基因操纵基因(O)：是阻遏物结合位点：是阻遏物结合位点ⅠⅠ ：：β-β-半乳糖苷酶结构基因半乳糖苷酶结构基因Ⅱ：透过酶结构基因：透过酶结构基因Ⅲ：转乙酰酶的结构基因：转乙酰酶的结构基因调节方式调节方式 Ø当乳糖当乳糖↑↑时时, ,cAMPcAMP含量增高含量增高↑→ ↑→ cAMPcAMP与与CAP CAP ( (分解产物激活剂蛋白分解产物激活剂蛋白) )结合成结合成CRPCRPØ该复合物与该复合物与启动基因上对应的位点结合启动基因上对应的位点结合后后Ø使使DNADNA双链不稳定；随后双链不稳定；随后RNARNA聚合酶则容易聚合酶则容易与启动基因紧密结合；与启动基因紧密结合；若此时操纵基因上无若此时操纵基因上无阻遏物阻遏物，则，则基因被打开基因被打开ØRNARNA聚合酶从聚合酶从DNADNA的的5’5’端开始滑动，即端开始滑动，即开始开始转录转录，并合成了，并合成了3 3种酶。

种酶当葡萄糖当葡萄糖↑→cAMP↓→CRP↓RNA聚合酶则不能与启动基因结合，也聚合酶则不能与启动基因结合，也就不能转录和合成就不能转录和合成3种酶p抑制基因转录和翻译成抑制基因转录和翻译成阻碍蛋白阻碍蛋白，并与，并与操纵基因结合操纵基因结合,阻止阻止RNA聚合酶滑动而抑聚合酶滑动而抑制转录这种情况又称为负调节制转录这种情况又称为负调节p如果如果阻遏蛋白与诱导物结合阻遏蛋白与诱导物结合(此处为乳此处为乳糖糖) 则这个复合物不能与操纵基因结合，则这个复合物不能与操纵基因结合，转录和翻译就能进行转录和翻译就能进行 u操纵子学说操纵子学说扩大了基因的概念扩大了基因的概念即结构基因和调节基因构基因和调节基因u调节基因发挥正、负调节受细胞内外调节基因发挥正、负调节受细胞内外环境因素的影响环境因素的影响形成了基因调控和表形成了基因调控和表达的概念达的概念u基因表达调控理论，不仅有助于理解基因表达调控理论，不仅有助于理解生命现象的本质，而且生命现象的本质，而且对基因工程对基因工程的建的建立是至关重要立是至关重要  （（3 3））DNADNA重组重组( (基因工程基因工程) )基因工程的两个重要工具：基因工程的两个重要工具：n一是一是内切酶内切酶，能特异地识别，能特异地识别DNADNA的碱基序列，的碱基序列，并在并在DNADNA链当中将链当中将DNADNA切开。

切开n二是二是载体载体，如质粒、噬菌体、病毒如质粒、噬菌体、病毒载体的共同特点：载体的共同特点： 环状环状DNADNA；；都能专一都能专一感染某一类细胞感染某一类细胞；具有；具有某种某种选择性标记选择性标记；都具有一些；都具有一些内切酶位点内切酶位点；；都能随着染色体的复制而都能随着染色体的复制而复制复制，随着细胞分，随着细胞分裂而裂而扩增扩增 基因工程的基本程序：基因工程的基本程序： ①①取得所需要的目的基因；取得所需要的目的基因； ②②将目的基因同载体连接；将目的基因同载体连接； ③③再将这个重组环状再将这个重组环状DNA引入受体引入受体细胞细胞(或称寄主细胞或称寄主细胞)；； ④④使目的基因得以表达，即基因转使目的基因得以表达，即基因转录和翻译成蛋白质录和翻译成蛋白质第二节 核酸的提取技术核酸的提取技术extractive technique of nucleic acid  1. 结合状态结合状态 2.形态：分线形和环形；分双链和单链形态：分线形和环形；分双链和单链 3.分布：分布： DNA分布在细胞核和细胞；分布在细胞核和细胞； RNA 分布在细胞质、细胞核和细胞器分布在细胞质、细胞核和细胞器（一）核酸在细胞中的存在状态和分布（一）核酸在细胞中的存在状态和分布（二）二）核酸分离提取的原则、要求核酸分离提取的原则、要求 1.1.原则：原则：(1)(1)应保证应保证核酸一级结构的完整性核酸一级结构的完整性；； (2)(2)排除其它分子的污染，排除其它分子的污染，纯度要高纯度要高。

2.2.对于核酸纯度的要求：对于核酸纯度的要求： (1)(1)对于核酸样品中不应存在对酶有抑制作用对于核酸样品中不应存在对酶有抑制作用 的的有机溶剂和过高浓度的金属离子有机溶剂和过高浓度的金属离子；； (2)(2)其它生物大分子如其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子蛋白质、多糖和脂类分子 污染应降低到最低程度；污染应降低到最低程度； (3)(3)排降其它核酸分子的污染排降其它核酸分子的污染，如提取，如提取DNADNA时，时， 应去除应去除RNARNA，，反之亦然反之亦然 3.3.注意事项注意事项 (1)(1)尽量尽量简化操作步骤简化操作步骤，缩短提取过程，，缩短提取过程，以减少各种有害因素对核酸的破坏以减少各种有害因素对核酸的破坏(2)(2)减少减少化学因素化学因素对核酸的降解，为避对核酸的降解，为避免过酸、过碱对核酸链中磷酸二酯键的免过酸、过碱对核酸链中磷酸二酯键的 破坏，操作多在破坏，操作多在pH4pH4～～1010条件下进行。

条件下进行(3)(3)减少减少物理因素物理因素对核酸的降解物理对核酸的降解物理因素主要是机械剪切力，其次是高温因素主要是机械剪切力，其次是高温机械剪切力主要来源于溶液的快速振荡，机械剪切力主要来源于溶液的快速振荡，搅拌等常规操作温度为搅拌等常规操作温度为0 0～～4℃4℃4)(4)避免避免生物因素生物因素对核酸的降解细胞对核酸的降解细胞内外均存在核酸酶，尤其是内外均存在核酸酶，尤其是RNARNA酶存在酶存在广泛、稳定，极易降解核酸因此提取广泛、稳定，极易降解核酸因此提取过程中，应注意采用核酸酶抑制剂和破过程中，应注意采用核酸酶抑制剂和破坏方法 ( (三三)DNA)DNA的提取、纯化的提取、纯化 真核细胞染色体真核细胞染色体DNADNA的制备的制备( (提取、纯化提取、纯化) ) 根据不同的实验要求，可有不同的根据不同的实验要求，可有不同的DNADNA提提取方法，如取方法，如酚抽提法，甲酰胺解聚法，玻璃酚抽提法，甲酰胺解聚法，玻璃棒缠绕法，异丙醇沉淀法棒缠绕法，异丙醇沉淀法等但这些方法在等但这些方法在基本原理及大致步骤上是基本相同的而且基本原理及大致步骤上是基本相同的。

而且酚抽提法比较经典常用酚抽提法比较经典常用，下面就以此方法为，下面就以此方法为例进行介绍例进行介绍 酚抽提法酚抽提法 酚抽提法的酚抽提法的基本原理基本原理：：u用用SDSSDS和蛋白酶和蛋白酶K K破坏和消化细胞破坏和消化细胞u用酚去除水相中的蛋白质等大分子物质用酚去除水相中的蛋白质等大分子物质u通过盐和乙醇沉淀获得通过盐和乙醇沉淀获得DNADNA 试剂：试剂： 1 磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液PBSPBS 2 DNA 2 DNA抽提缓冲液：抽提缓冲液： 10mmol/L 10mmol/L Tris.clTris.cl ( (缓冲溶液的缓冲溶液的pHpH值值，，pH8.0)pH8.0) 0.1mol/L EDTA(0.1mol/L EDTA(金属离子络合剂金属离子络合剂，可，可抑制抑制DNADNA聚合聚合酶活性酶活性) ) 20μg/ml 20μg/ml 胰胰RNARNA酶酶( (破坏降解破坏降解RNARNA) ) 0.5% SDS( 0.5% SDS(表面活性剂，表面活性剂，破坏细胞破坏细胞) 蛋白酶蛋白酶K (K (消化细胞、消化细胞、破坏细胞破坏细胞) )3．．20mg/ml蛋白酶蛋白酶K，消化细胞，破坏细胞，消化细胞，破坏细胞4．酚（用．酚（用0.5 mol/L Tris·Cl，，pH 8.0饱和），饱和），主要作用是主要作用是沉淀蛋白质沉淀蛋白质等等5．．10 mol/L NH4Ac，其作用是，其作用是沉淀沉淀DNA6．乙醇，其作用是．乙醇，其作用是沉淀沉淀DNA7．．TE（（Tris和和EDTA混合液），是混合液），是溶解保存溶解保存DNA的最好溶液的最好溶液8．透析液：．透析液： 50 mmol/L Tris·Cl，，pH 8.0 10 mmol/L EDTA，，pH 8.0 样品前处理样品前处理 (1)(1)生物组织：生物组织：新鲜的生物组织，先新鲜的生物组织，先用剪切刀清除组织中筋膜等结缔组织，吸用剪切刀清除组织中筋膜等结缔组织，吸干血液。

若不能马上进行干血液若不能马上进行DNADNA提取，可将提取，可将生物组织贮存于生物组织贮存于液氮中或液氮中或-70℃-70℃冰箱中冰箱中a.a.取取1 1～～3g3g左右的组织，用左右的组织，用8 8层纱布包好，层纱布包好，外层再包多层牛皮纸，浸入液氮中使组织外层再包多层牛皮纸，浸入液氮中使组织结冻，取出后用结冻，取出后用木锤将其敲碎木锤将其敲碎b.b.将敲碎的组织放入搪瓷研钵中，加入少将敲碎的组织放入搪瓷研钵中，加入少许液氮，用许液氮，用研杵碾磨研杵碾磨需反复添加液氮反复添加液氮C.C.在离心管中在离心管中加入加入10ml DNA10ml DNA抽提液抽提液，用玻璃，用玻璃棒边搅动边加入组织粉末，然后棒边搅动边加入组织粉末，然后37℃37℃保温保温1 1小小时 (先加抽提液，后加组织粉末，有利于充先加抽提液，后加组织粉末，有利于充分溶解，用玻璃棒而不用金属棒，分溶解，用玻璃棒而不用金属棒，减小损伤减小损伤DNADNA的机率的机率，，37℃37℃保温保温1 1小时，一方面有利于小时，一方面有利于SDSSDS破坏细胞，更主要是为了使溶液平衡温度破坏细胞，更主要是为了使溶液平衡温度达到达到37℃37℃，为下一步反应准备适宜条件，为下一步反应准备适宜条件) )。

(2)(2)培养的细胞培养的细胞 a.a.收集细胞收集细胞，悬浮培养，悬浮培养( (生长生长) )的细胞；的细胞；可以直接经可以直接经1500g1500g离心离心(4℃,10(4℃,10分钟分钟) )，以收，以收集细胞；贴壁生长的细胞，用胰酶消化后集细胞；贴壁生长的细胞，用胰酶消化后再离心收集再离心收集细胞数应在细胞数应在5×105×107 7左右左右 b.b.漂洗细胞漂洗细胞，将离心沉淀的细胞用冰预，将离心沉淀的细胞用冰预冷的冷的PBSPBS液或生理盐水，漂洗液或生理盐水，漂洗1 1次再离心，次再离心，弃上清收集细胞可重复漂洗弃上清收集细胞可重复漂洗1-21-2次次( (目的目的去除培养液成分和细胞分泌的蛋白去除培养液成分和细胞分泌的蛋白) ) c.c.保温保温，再用，再用10ml DNA10ml DNA抽提液将细胞沉抽提液将细胞沉淀悬浮，并在淀悬浮，并在37℃37℃保温保温1 1小时 (1)(1)消化消化 向上述预处理好的样品溶液中向上述预处理好的样品溶液中( (样品溶解在样品溶解在DNADNA抽提液并保温抽提液并保温1 1小时小时) )，加，加入入20mg/ml20mg/ml的蛋白酶的蛋白酶K K，，至终浓度为至终浓度为100μg/ml100μg/ml，边加边用，边加边用玻璃棒轻轻搅拌，使玻璃棒轻轻搅拌，使溶液至粘稠状溶液至粘稠状( (细胞破裂，蛋白、核酸释放细胞破裂，蛋白、核酸释放) )。

将反应液在将反应液在50℃50℃水浴上，保温水浴上，保温3h3h，，裂解裂解细胞，消化蛋白保温过程中，应不时轻细胞，消化蛋白保温过程中，应不时轻轻摇匀反应液轻摇匀反应液 DNADNA提取步骤提取步骤(2)(2)加酚混匀加酚混匀 将反应液冷却至室温，加入等将反应液冷却至室温，加入等容积容积已饱和的酚溶液已饱和的酚溶液，轻轻地上下转动离心，轻轻地上下转动离心管，混匀两相，反复该动作管，混匀两相，反复该动作10min10min，，直至水相直至水相与酚相混匀并成乳状液若没有达到这种效与酚相混匀并成乳状液若没有达到这种效果，可用多角度振荡器温和地混匀果，可用多角度振荡器温和地混匀1 1小时小时(3)(3)离心离心 室温室温5000g5000g，，离心离心15min15min，，使两相分使两相分开开( (水相在上层，酚相在下层水相在上层，酚相在下层) )，，(DNA(DNA在水相，在水相，因水溶性，带负电荷因水溶性，带负电荷) )4)(4)取上层水相用酚重复抽提两次，取上层水取上层水相用酚重复抽提两次，取上层水相时，应用大口径相时，应用大口径(0.3cm)(0.3cm)吸管，因水相粘稠吸管，因水相粘稠 (5)(5)又分两种情况又分两种情况 a.a.透析处理：为提取大分子量透析处理：为提取大分子量DNA(200KbDNA(200Kb以上以上) )，在第，在第3 3次酚抽提后，将次酚抽提后，将DNADNA溶液装入透析袋中，并放入溶液装入透析袋中，并放入4℃4℃透析液中。

每次透析液透析液中每次透析液1 1升，换升，换4 4次透析液，直至透析次透析液，直至透析物物ODOD270270小于小于0.050.05，才算透析完毕才算透析完毕b.b.沉淀处理，对于沉淀处理，对于100100～～150Kb150Kb大小的大小的DNADNA提取，在第提取，在第三次酚抽提后，将上层水相移入一个新的离心管中，三次酚抽提后，将上层水相移入一个新的离心管中，加入加入0.20.2倍容积的倍容积的10mol/L10mol/L乙酸铵乙酸铵和和2 2倍容积倍容积95%95%乙醇室温下轻轻摇动，立刻就可看到乳白色丝状沉淀出现，室温下轻轻摇动，立刻就可看到乳白色丝状沉淀出现，用一个前端为钩状的玻璃棒用一个前端为钩状的玻璃棒( (挑挑) )出出DNADNA纤维，立即放纤维，立即放入入70%70%乙醇中漂洗乙醇中漂洗2 2次次室温5000g5000g，，离心离心5min5min，，弃上弃上清室温下挥发残留乙醇但注意不要使清室温下挥发残留乙醇但注意不要使DNADNA沉淀完沉淀完全干燥然后加全干燥然后加TE(pH8.0)TE(pH8.0)溶解溶解DNA 12DNA 12～～24h24h (6)(6)测定样品在测定样品在260nm260nm和和280nm280nm的的ODOD值，计值，计算算DNADNA含量和含量和A260/A280A260/A280比值。

比值 260nm260nm处，是核酸的最大吸收波长，在处，是核酸的最大吸收波长，在280nm280nm处是蛋白质最大吸收波长处是蛋白质最大吸收波长 在在260nm260nm紫外线下，紫外线下，1OD1OD的光密度值相的光密度值相当于双链当于双链DNADNA浓度为浓度为50μg/ml50μg/ml；；单链单链DNADNA或或RNARNA为为40μg/ml40μg/ml因此根据核酸的因此根据核酸的ODOD值，值，计算核酸样品的浓度或含量计算核酸样品的浓度或含量n根据根据A260A260/A280A280比值，可判断所提取核酸比值，可判断所提取核酸(DNA)(DNA)的的纯度DNADNA纯度比较理想的比值是纯度比较理想的比值是1.81.8，，RNARNA比值是比值是2.02.0若DNADNA比值比值高于高于1.81.8，说明有，说明有RNARNA的污染的污染，，低低于于1.81.8或或1.751.75，则认为是蛋白质或酚污染，则认为是蛋白质或酚污染RNARNA比比值小于值小于2.02.0，则认为也是蛋白质或酚的污染则认为也是蛋白质或酚的污染nDNADNA样品纯度不符合要求样品纯度不符合要求( (尤其是尤其是A260/A280A260/A280比值比值小于小于1.81.8时时) ) 可用酚或酚可用酚或酚/ /氯仿和氯仿抽提氯仿和氯仿抽提2-32-3次，次， 用乙醚除去残留氯仿，再挥掉乙醚。

用乙醚除去残留氯仿，再挥掉乙醚 最后用盐和乙醇沉淀，用最后用盐和乙醇沉淀，用TETE溶解 本方法需要说明的几点：本方法需要说明的几点：(1) 5×10(1) 5×107 7细胞提取产量为细胞提取产量为200μg200μg左右2)(2)对于上层水相比较粘稠，吸取上层水相时，对于上层水相比较粘稠，吸取上层水相时，会牵动两相之间的蛋白质沉淀层此时可用吸会牵动两相之间的蛋白质沉淀层此时可用吸管插到管底吸取酚相管插到管底吸取酚相( (采用负压采用负压) )，至蛋白质层，至蛋白质层时，停止并离心时，停止并离心(5000g,20(5000g,20分钟分钟) )，沉淀蛋白，沉淀蛋白质，吸取上清液质，吸取上清液3)(3)由于由于0.5% 0.5% SDSSDS的存在的存在，可抑制部分胰，可抑制部分胰RNARNA酶酶活性，故活性，故应加大该酶用量应加大该酶用量，一般为，一般为20 20 μgμg/ml/ml(4)(4)所用酚，所用酚，应重蒸酚应重蒸酚，，并用水饱和并用水饱和（四）（四）RNA的分离与纯化的分离与纯化1. 1. 创造一个无创造一个无RNARNA酶酶( (RNaseRNase) )的环境的环境ØRNARNA酶酶在环境中无处不在在环境中无处不在：空气中灰尘、：空气中灰尘、微生物，人体汗液、唾液，以及各种器皿微生物，人体汗液、唾液，以及各种器皿和试剂等，均存在和试剂等，均存在RNaseRNase 。

ØRNaseRNase非常稳定非常稳定，耐热、耐酸，耐碱蛋，耐热、耐酸，耐碱蛋白质变性剂可使之暂时失活白质变性剂可使之暂时失活 ØRNaseRNase活性活性不需要辅助因子不需要辅助因子，因此，因此EDTAEDTA对对此酶无抑制作用此酶无抑制作用 (1)(1)去除外源性去除外源性RNaseRNase的的污染污染①①空气中的细菌、霉菌等微生物都含有空气中的细菌、霉菌等微生物都含有RNaseRNase，所以整个操作过程应，所以整个操作过程应在比较清洁的环境中在比较清洁的环境中进行进行因此有必要对操作场所的空气进行消因此有必要对操作场所的空气进行消毒②②操作者操作应操作者操作应戴口罩和手套、带帽子戴口罩和手套、带帽子③③玻璃器皿玻璃器皿常规洗净后，应用常规洗净后，应用0.1%DEPC(0.1%DEPC(二乙二乙基焦碳酸盐基焦碳酸盐) )浸泡处理浸泡处理(37℃(37℃，，2h)2h)，，再用灭菌再用灭菌去离子水漂洗几次高压消毒去除去离子水漂洗几次高压消毒去除DEPCDEPC，，然然后后250℃250℃烘烤烘烤4h4h以上或以上或200℃200℃干烤过夜干烤过夜④④塑料器材最好使用塑料器材最好使用灭菌的一次性塑料灭菌的一次性塑料用品。

用品EppendorfEppendorf管，微量加样吸头最好是新的，管，微量加样吸头最好是新的，使用前进行高压消毒使用前进行高压消毒⑤⑤所有所有溶液应加溶液应加DEPCDEPC至至0.05-0.1%0.05-0.1%，，室温过室温过夜，然后高压消毒以去除残留的夜，然后高压消毒以去除残留的DEPCDEPC⑥⑥RNARNA提取所用的酚，应单独配制和使用提取所用的酚，应单独配制和使用配制饱和酚盐溶液时，使用的水应预先以配制饱和酚盐溶液时，使用的水应预先以DEPCDEPC处理且高压消毒，处理且高压消毒，酚饱和以后，加入酚饱和以后，加入8-8-羟基喹啉至羟基喹啉至0.1%0.1%8-8-羟喹啉不但抗氧化，而羟喹啉不但抗氧化，而且有一定的且有一定的RNARNA酶酶抑制作用抑制作用 ØDEPCDEPC的分子式为的分子式为C C2 2H H5 5-O-CO-O-CO-O-C-O-CO-O-CO-O-C2 2H H5 5二乙基二乙基焦碳酸盐焦碳酸盐是一种粘性液体，对核酸酶有很强的是一种粘性液体，对核酸酶有很强的抑制作用抑制作用Ø作用机制是通过作用机制是通过与蛋白质中的组氨酸结合与蛋白质中的组氨酸结合，使，使蛋白质变性。

蛋白质变性ØDEPCDEPC又能与又能与RNARNA或单链或单链DNADNA反应，反应，破坏单链核酸破坏单链核酸中大部分腺嘌呤，中大部分腺嘌呤，但它破坏单链核酸的浓度要比但它破坏单链核酸的浓度要比使蛋白质变性的使蛋白质变性的浓度大浓度大100-1000100-1000倍倍Ø使用使用DEPCDEPC的一个原则是，在达到使用目的后，的一个原则是，在达到使用目的后，一般要一般要高温处理以便破坏除掉高温处理以便破坏除掉DEPCDEPC，使，使DEPCDEPC不与不与RNARNA接触 pDEPCDEPC可可与与TrisTris发生反应，分解成发生反应，分解成COCO2 2和乙和乙醇醇，使，使pHpH值下降值下降（所以要去除）（所以要去除）p配制配制TrisTris溶液时，先将溶液时，先将所用水用所用水用DEPCDEPC处处理高压消毒理高压消毒p配完配完TrisTris溶液后，再经高压消毒溶液后，再经高压消毒pDEPCDEPC与肝素联合使用与肝素联合使用，增强使用效果增强使用效果pDEPCDEPC应在应在4℃4℃或液氮中保存，以防降解或液氮中保存，以防降解 (2)(2)抑制内源性抑制内源性RNaseRNase的活性的活性。

ü细胞裂碎的同时，细胞裂碎的同时，RNaseRNase释放出来释放出来ü原则上应原则上应尽早去除细胞内蛋白尽早去除细胞内蛋白，加入，加入RNaseRNase抑制剂，力争在提取的起始阶段对抑制剂，力争在提取的起始阶段对RNaseRNase活力进行有效地抑制活力进行有效地抑制ü不同组织细胞中内源性不同组织细胞中内源性RNaseRNase的数量不同，的数量不同，胰腺、脾组织胰腺、脾组织细胞中细胞中RNaseRNase的含量极为丰富，的含量极为丰富，在对这些组织提取在对这些组织提取RNARNA时，更要使用强有力时，更要使用强有力的的RNaseRNase抑制剂 抑制剂可分为以下几类：抑制剂可分为以下几类： ①①低特异性低特异性RNaseRNase抑制剂，如抑制剂，如皂土、复合硅酸皂土、复合硅酸盐、肝素、多胺盐、肝素、多胺等，因作用较弱，现已不大等，因作用较弱，现已不大使用②②去除蛋白质物质去除蛋白质物质 蛋白质变性剂蛋白质变性剂，蛋白，蛋白K K、、阴离子去污剂，阴离子去污剂，常常与与RNARNA酶抑制剂联合使用酶抑制剂联合使用，以加强对，以加强对RNaseRNase的的抑制作用。

凡能破坏蛋白质的物质，对抑制作用凡能破坏蛋白质的物质，对RNaseRNase均有一定作用，因为酶本身就是蛋白质均有一定作用，因为酶本身就是蛋白质 a.a.酚、氯仿酚、氯仿 这类有机溶剂这类有机溶剂不但能使核蛋白与核不但能使核蛋白与核酸解聚酸解聚( (但不能破坏核酸但不能破坏核酸) )，而且对蛋白质有变性，而且对蛋白质有变性作用因而对酶作用因而对酶( (RNaseRNase) )有抑制作用有抑制作用酚不能完酚不能完全抑制全抑制RNaseRNase活性，但酚一般都加入了活性，但酚一般都加入了8 8－羟基喹－羟基喹啉啉( (一种抗氧化剂，一种指示剂一种抗氧化剂，一种指示剂) )，因而加强了对，因而加强了对RNaseRNase的抑制效果氯仿的抑制效果比较强，因的抑制效果氯仿的抑制效果比较强，因此酚与氯仿常联合使用此酚与氯仿常联合使用 蛋白酶蛋白酶K K也能抑制也能抑制RNaseRNase活性有一种情况挺特活性有一种情况挺特殊，即该酶在殊，即该酶在1 1－－2 2％的％的SDSSDS存在下，其活性反而存在下，其活性反而会增加 b.b.去污剂去污剂 包括包括SDS(SDS(十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠) )，，十二烷十二烷酰肌氨酸钠，脱氧胆酸钠等阴离子去污剂。

这些酰肌氨酸钠，脱氧胆酸钠等阴离子去污剂这些阴离子去污剂可使核酸与蛋白质解聚，并可与蛋阴离子去污剂可使核酸与蛋白质解聚，并可与蛋白质侧链上带正电荷的基团结合，在高浓度白质侧链上带正电荷的基团结合，在高浓度KClKCl存在下，形成存在下，形成SDSSDS－－蛋白质复合物而沉淀蛋白质复合物而沉淀 c.c.解偶剂解偶剂（胍类）盐酸胍，（胍类）盐酸胍，异硫氰酸胍异硫氰酸胍，作用，作用非常强的一种蛋白变性剂，可完全破坏蛋白质二非常强的一种蛋白变性剂，可完全破坏蛋白质二级结构，从而使细胞结构降解，核酸与核蛋白分级结构，从而使细胞结构降解，核酸与核蛋白分离，所以又称解偶剂离，所以又称解偶剂 ③ ③ RNaseRNase的特异抑制剂的特异抑制剂a. a. RNaseRNase阻抑蛋白阻抑蛋白( (RNasinRNasin) )，，是一种酸性糖蛋白可与是一种酸性糖蛋白可与RNaseRNase以非以非共价键的形式结合，从而抑制共价键的形式结合，从而抑制RNaseRNase活性，活性， RNasinRNasin最好不与蛋白质变性剂一同使用最好不与蛋白质变性剂一同使用，因变性剂亦，因变性剂亦可破坏可破坏RNasinRNasin ，，从而使其丧失作用。

但可与二巯基从而使其丧失作用但可与二巯基乙醇一同使用，可增强乙醇一同使用，可增强RNasinRNasin的的使用效果使用效果b.b.氧钒核糖核苷复合物氧钒核糖核苷复合物，这也是一种，这也是一种RNaseRNase特异性抑特异性抑制剂，几乎可完全抑制制剂，几乎可完全抑制RNaseRNase的的活性 为达到完全、彻底抑制为达到完全、彻底抑制RNaseRNase活性的目的，活性的目的，常联合常联合使用使用，而且有些抑制剂，而且有些抑制剂( (去除蛋白质物质去除蛋白质物质) )一般有一般有4 4种种作用；作用；破坏细胞膜，使核酸与蛋白质分离，沉淀蛋白破坏细胞膜，使核酸与蛋白质分离，沉淀蛋白质、抑制质、抑制RNaseRNase活性因此几乎包括了因此几乎包括了RNARNA提取、分离、提取、分离、纯化的所有目的纯化的所有目的 2.RNA2.RNA的分离、提取方法的分离、提取方法步骤：步骤： (1)(1)创造一个无创造一个无RNaseRNase环境；环境； (2)(2)组织或细胞的匀浆，同时得加入组织或细胞的匀浆，同时得加入RNaseRNase抑制剂抑制剂 (3)(3)裂解细胞；裂解细胞； (4)(4)去除蛋白、去除蛋白、DNADNA等大分子物质；等大分子物质； ( (5)5)沉淀沉淀RNARNA；； (6)(6)漂洗；漂洗； (7)(7)溶解溶解RNARNA。

 酚酚：使核酸与核蛋白分离、变性沉淀蛋使核酸与核蛋白分离、变性沉淀蛋 白质，抑制白质，抑制RNaseRNase活性异硫氰酸胍异硫氰酸胍：破坏裂解细胞，使核酸与：破坏裂解细胞，使核酸与核蛋白分离，变性沉淀蛋白质，同是具核蛋白分离，变性沉淀蛋白质，同是具有很强的有很强的RNaseRNase抑制作用这是一个关键抑制作用这是一个关键的试剂，由于它是万能的，所以实验步的试剂，由于它是万能的，所以实验步骤变得简单骤变得简单TrizolTrizol试剂盒所提供的试剂：试剂盒所提供的试剂：自己需要配制的试剂自己需要配制的试剂氯仿：蛋白质变性作用，增强对氯仿：蛋白质变性作用，增强对RNaseRNase抑抑制作用异丙醇：沉淀异丙醇：沉淀RNARNA7575％％乙醇：漂洗、去除盐、残留有机溶剂乙醇：漂洗、去除盐、残留有机溶剂等杂质无无RNaseRNase水或水或0.5%SDS0.5%SDS溶液溶液( (后者较好后者较好)()(必必须用须用DEPCDEPC处理处理) ) ①①匀浆化匀浆化 a.a.组织：组织：取取50-100mg50-100mg组织放在匀浆管中，组织放在匀浆管中，加加1ml 1ml TrizolTrizol试剂，然后进行匀浆，此时裂解试剂，然后进行匀浆，此时裂解细胞和细胞和RNaseRNase抑制同时进行。

抑制同时进行 b.b.贴壁生长细胞贴壁生长细胞：倒掉培养液，然后直接：倒掉培养液，然后直接向培养瓶向培养瓶( (皿皿) )中加入中加入TrizolTrizol试剂试剂( (按按10cm10cm2 2加加1ml 1ml TrizolTrizol试剂计算加入量试剂计算加入量) ) c.c.悬浮生长细胞悬浮生长细胞：离心收集细胞，然后加：离心收集细胞，然后加入入TrizolTrizol试剂（按试剂（按5 5～～10×1010×106 6或或1×101×107 7细菌加细菌加入入1ml1ml比例计算加入量比例计算加入量) )操作步骤操作步骤②②两相分离两相分离 将匀浆化的样品在将匀浆化的样品在1515℃～～30℃30℃环境中放置环境中放置5min5min，，以便核酸蛋白复合物充分解聚以便核酸蛋白复合物充分解聚加Trizol试剂之前，样品试剂之前，样品一定要保持低温，防止一定要保持低温，防止RNase 发挥作用，在研磨过程中可加液氮发挥作用，在研磨过程中可加液氮））然然后按每后按每1ml 1ml TrizolTrizol试剂加入试剂加入0.2ml0.2ml氯仿的比例加入氯仿的比例加入氯仿。

盖紧试管盖，用手剧烈振荡氯仿盖紧试管盖，用手剧烈振荡1515秒，之后在秒，之后在1515 ～～30℃30℃条件保温条件保温2 2～～3min3min离心：离心：12000g12000g离心离心15min15min，，离心时温度要控制在离心时温度要控制在2℃2℃～～8℃8℃12000g12000g离心是一个关键步骤离心是一个关键步骤，也是该方法独到之处，可，也是该方法独到之处，可将将蛋白质，蛋白质，DNADNA等大分子沉淀等大分子沉淀) )离心之后，就会形成离心之后，就会形成三相：下层是红色的酚和氯仿（含有蛋白质和三相：下层是红色的酚和氯仿（含有蛋白质和DNADNA）；）；中间层是白色的中间层是白色的DNADNA和蛋白质沉淀；上层是和蛋白质沉淀；上层是水相，水相，RNARNA就在此层，水相大约占总体积的就在此层，水相大约占总体积的6060％％ ③③ RNARNA沉淀沉淀 将水相转移到一个新的试管中，并加入异丙醇将水相转移到一个新的试管中，并加入异丙醇混匀，加入量按每混匀，加入量按每ml ml TrizolTrizol试剂加试剂加0.5ml0.5ml异丙醇计异丙醇计。

在在1515 ～～30℃30℃条件下，保温条件下，保温10min10min然后在然后在2 2～～8℃8℃条件下，条件下，12000g12000g离心离心10min10min，，此时就会在管底或底此时就会在管底或底部边上出现部边上出现RNARNA沉淀，离心之前，沉淀，离心之前，RNARNA沉淀通常看不沉淀通常看不见，离心之后常常可看见胶样沉淀见，离心之后常常可看见胶样沉淀 ④④RNARNA漂洗漂洗 移去上清液，加入移去上清液，加入7575％乙醇至少％乙醇至少1ml1ml，，涡旋振涡旋振动几次，然后以动几次，然后以7500g7500g离心离心5min(5min(温度温度2 2 ～～8℃)8℃)，，又可形成又可形成RNARNA沉淀，并移去上清液沉淀，并移去上清液 ⑤⑤重新溶解重新溶解RNARNA 将将RNARNA沉淀在空气中放量沉淀在空气中放量5 5～～10min10min，，以便挥发以便挥发掉残留的乙醇注意掉残留的乙醇注意干燥时间不宜太长干燥时间不宜太长，以防，以防RNARNA完全干燥完全干燥的完全干燥完全干燥的RNARNA很难溶解。

最后用无很难溶解最后用无RNaseRNase水或水或0.50.5％％SDSSDS溶液溶解溶液溶解RNARNA，并用移液管，并用移液管吹吹打几次，并在打几次，并在5555℃ ～～60℃60℃保温保温10min10min，，以便使以便使RNARNA完全溶解完全溶解 ⑥⑥判定纯度和计算含量，用紫外分光光度计测判定纯度和计算含量，用紫外分光光度计测量溶液的吸光度质（量溶液的吸光度质（A A）A260/280A260/280在在1.61.6～～1.81.8之间表明比较纯净，符合之间表明比较纯净，符合实验要求实验要求1OD1OD值＝值＝40μg RNA,40μg RNA,据此再计算据此再计算RNARNA含量 一般来讲，该方法可从一般来讲，该方法可从1mg1mg组织中提取的组织中提取的RNARNA含量含量分别为：分别为：肝和脾为肝和脾为6 6～～10μg 10μg ；；肾肾3 3～～4μg 4μg ，，肌肉和肌肉和脑为脑为1 1～～5μg 5μg ，，胎盘胎盘1 1～～4μg 4μg 对培养的细胞来讲，对培养的细胞来讲，1×101×106 6个上皮细胞中可提取个上皮细胞中可提取8 8～～15μg 15μg ，，成纤维细胞成纤维细胞5 5～～7μg 7μg 。

用用TrizolTrizol试剂盒法提取的试剂盒法提取的RNARNA，，基本上可满足所基本上可满足所有实验的需要有实验的需要，如，如Northern blotNorthern blot，，斑点杂交，斑点杂交，mRNAmRNA分离、体外翻译，分子克隆等分离、体外翻译，分子克隆等 该方法操作简便，提取的该方法操作简便，提取的RNARNA完整，整个提取过完整，整个提取过程仅需程仅需1h1h，，故现在广泛使用故现在广泛使用第三节 核酸分子杂交技术核酸分子杂交技术  1.1.探针的概念：在化学及生物学意义上的探针探针的概念：在化学及生物学意义上的探针(Probe)(Probe)，，是指能与特定的靶分子发生特异性相互是指能与特定的靶分子发生特异性相互作用的分子，并可被特殊的方法所探知作用的分子，并可被特殊的方法所探知( (检测到检测到) )所谓核酸分子探针则是指特定的已知核酸片段，并所谓核酸分子探针则是指特定的已知核酸片段，并带有标记物，能与互补核酸序列退火杂交，因此可带有标记物，能与互补核酸序列退火杂交，因此可以用于待测核酸样品中特定基因顺序的探测（可定以用于待测核酸样品中特定基因顺序的探测（可定性、定量）。

性、定量） (一一) )探针的概念、种类及其选择、探针的标记探针的概念、种类及其选择、探针的标记2.探针的种类、选择及特点探针的种类、选择及特点种类：种类：基因组基因组DNA探针、探针、cDNA探针、探针、RNA探探 针、寡核苷酸探针针、寡核苷酸探针选择：选择：寡核苷酸探针寡核苷酸探针 寡核苷酸探针是指人工合成的短链核苷寡核苷酸探针是指人工合成的短链核苷 酸片段，并带有标记物酸片段，并带有标记物特点：特点：人为控制，杂交时间短，特异性高，可人为控制，杂交时间短，特异性高，可 以用于点突变检测；缺点是灵敏度低以用于点突变检测；缺点是灵敏度低  设计寡核苷酸探针应遵循的（以下）几个原则：设计寡核苷酸探针应遵循的（以下）几个原则： ①①探探针针长长度度：：一一般般要要求求1010～～50bP50bP过过短短则则特特异异性性降降低低，，过过长长，，则则合合成成困困难难、、杂杂交交时时间间延延长长，，亦亦会会出出现现非非特特异异性性杂杂交交应不短不长应不短不长 （一般（一般20bp20bp）） ②② G G：：C C碱碱基基对对含含量量应应占占4040～～6060％％；；过过少少，，则则不不易易杂杂交交，，或或杂杂交交双双链链不不稳稳定定；；过过多多，，则则会会产产生生非非特特异异性性杂杂交交，，应应不不多多也不少。

一般也不少一般ATAT、、GCGC各占各占50%50%）） ③③探探针针内内部部的的互互补补碱碱基基对对不不应应大大于于4bP4bP，，否否则则会会形形成成探探针针内部的内部的““发夹发夹””结构 ④④同一碱基的连续出现次数不应超过同一碱基的连续出现次数不应超过4 4次 ⑤⑤探探针针设设计计完完后后，，最最好好利利用用基基因因库库软软件件进进行行分分析析，，并并与与已已知知的的各各种种基基因因序序列列进进行行同同源源性性比比较较，，如如果果该该探探针针与与非非目目的的基基因因序序列列有有7070％％以以上上的的同同源源性性，，或或连连续续有有8 8个个以以上上的的碱碱基基序序列列相相同，则应重新设计探针序列同，则应重新设计探针序列3.探针的标记物与标记探针的标记物与标记 标记物：标记物： 放射性核素：放射性核素：32P、、35S、、3H、、125I、、131I 非放射性标记物：半抗原（生物素、地高辛）非放射性标记物：半抗原（生物素、地高辛）；配体；荧光素；化学发光物；配体；荧光素；化学发光物 根据待测核酸分子存在的部位不同，可分固相根据待测核酸分子存在的部位不同，可分固相杂交（膜上印迹杂交、细胞原位杂交）和液相杂交。

杂交（膜上印迹杂交、细胞原位杂交）和液相杂交其中膜上印迹杂交应用广泛其中膜上印迹杂交应用广泛 膜上印迹杂交是指将待测核酸序列片段结合到膜上印迹杂交是指将待测核酸序列片段结合到一定的固相支持物上，然后与存在于液相中标记的一定的固相支持物上，然后与存在于液相中标记的核酸探针进行杂交的过程核酸探针进行杂交的过程 （二）杂交（二）杂交 首首先先用用凝凝胶胶电电泳泳方方法法将将待待测测核核酸酸片片段段分分离离，，然然后后用用印印迹迹技技术术将将分分离离的的核核酸酸片片段段转转移移到到特特异异的的固固相相支支持持物物上上（（转转移移后后的核酸片段将保持其原来的相对位置不变）的核酸片段将保持其原来的相对位置不变） 再再用用标标记记的的核核酸酸探探针针与与固固相相支支持持物物上上的的核核酸酸片片段段进进行行杂杂交交 最最后后洗洗去去未未杂杂交交的的游游离离的的探探针针分分子子，，通通过过放放射射自自显显影影等等检测检测方法显示标记的探针的位置及量的多少方法显示标记的探针的位置及量的多少 概括起来，杂交主要包括三个步骤：印迹、杂交和检测概括起来，杂交主要包括三个步骤：印迹、杂交和检测。

膜上印迹杂交的基本操作流程膜上印迹杂交的基本操作流程1.印迹技术印迹技术 印迹技术是指将待测核酸分子印迹技术是指将待测核酸分子转移转移并结合并结合到一定的到一定的固相支持物固相支持物上的方法上的方法 印迹技术主要包括两个关键因素：选择良印迹技术主要包括两个关键因素：选择良好的固相支持物；有效的转移方法好的固相支持物；有效的转移方法 ⑴⑴ 固相支持物的选择固相支持物的选择 ①①具有良好的机械性能，如柔软性好，韧性强，以便操作具有良好的机械性能，如柔软性好，韧性强，以便操作 时不易损坏；时不易损坏；②②具有较强的结合核酸分子的能力；具有较强的结合核酸分子的能力；③③与核酸分子结合后，应不影响其与探针分子的杂交反应；与核酸分子结合后，应不影响其与探针分子的杂交反应；④④与核酸分子的结合稳定、牢固，能经受杂交、洗膜等操与核酸分子的结合稳定、牢固，能经受杂交、洗膜等操 作过程，而不会脱落或脱落极少；作过程，而不会脱落或脱落极少；⑤⑤非特异性吸附较少，即使有，在洗膜时也易被洗脱掉非特异性吸附较少，即使有，在洗膜时也易被洗脱掉 硝酸纤维素滤膜硝酸纤维素滤膜尼龙膜尼龙膜化学活化膜化学活化膜滤纸滤纸其中前其中前2种更为常用种更为常用 目前常用的固相支持物目前常用的固相支持物硝酸纤维素滤膜硝酸纤维素滤膜 具具有有较较强强的的吸吸附附结结合合单单链链DNA和和RNA的的能能力力，，特特别别是是在在高高盐盐浓浓度度，，其其结结合合力力可可达达80μg/cm2～～100μg/cm2。

这这种种结结合合主主要要靠靠疏疏水水作作用用非非特特异异性性吸吸附附核核酸酸（（探探针针））能能力力较较弱弱，，因因此此杂杂交交信信号号本本底底值值较较低低 常常用用于于Southern、、Northern斑斑点点印印迹迹及克隆筛选等实验及克隆筛选等实验缺点：缺点：①①与与核核酸酸的的结结合合力力较较弱弱（（因因为为是是靠靠疏疏水水作作用用）），，在在杂杂交交及及洗洗脱脱的的进进程程中中，，核核酸酸会会慢慢慢慢脱脱落落，，特特别别是是在在高高温温情情况况下下，，更更容容易易脱脱落落，，从从而而使使杂杂交交率率下下降降另另外外硝硝酸酸纤纤维维素素膜膜对对于于小小分分子子量量DNA片片段段结结合合力力更更弱弱，，因因此此不不太太适适合合小小分分子子DNA片片段段的的杂杂交②②硝硝酸酸纤纤维维素素膜膜质质地地较较脆脆，，特特别别是是经经烘烘烤烤后后更更易易破破损损，，因因此此操作不方便，须特别小心操作不方便，须特别小心另另外外值值得得注注意意的的是是，，硝硝酸酸纤纤维维素素膜膜与与核核酸酸的的结结合合，，有有赖赖于于高高盐盐浓浓度度，，而而高高盐盐溶溶液液又又不不适适合合于于电电转转印印迹迹法法（（电电流流大大，，产产热热））。

尼龙膜尼龙膜 尼尼龙龙膜膜是是目目前前较较理理想想的的一一种种核核酸酸固固相相支支持持物物，，它它有有多多种种类类型型有有的的尼尼龙龙膜膜未未经经特特殊殊处处理理，，叫叫普普通通尼尼龙龙膜膜有有些些则则是是经经过过了了正正电电荷荷基基团团的的修修饰饰，，又又叫叫特特殊殊尼尼龙龙膜膜特特殊殊尼尼龙龙膜膜带带有有正正电电荷荷，，核核酸酸带带有有负负电电荷荷，，因因此此二二者者可可靠靠静静电电吸吸引引牢牢固固结结合合因因此此尼尼龙龙膜膜对对核核酸酸的的结结合合力力要要比比硝硝酸酸纤纤维维素素膜膜强强好好多多倍倍特特别别是是经经短短波波紫紫外外线线照照射射后后，，核核酸酸中中的的部部分分嘧嘧啶啶碱碱基基可可与与膜膜上上的的带带正正电电荷荷的的氨氨基基相相互互交交联联，，从从而而使使结结合合更更加加牢牢固固因因此此特特别别适适用用于于小小分分子子核核酸酸片片段段的的杂杂交交另另外外碱碱处处理理也也可可使使核核酸酸牢牢固固地地结结合合在在尼尼龙龙膜膜上上，，因因此此使使DNA的的变变性性、、吸吸附附和和固固定定可可一一步步完完成成，，特特别别适适用用于于菌菌落落原原位位印印迹法 尼尼龙龙膜膜质质地地坚坚韧韧，，不不易易损损坏坏，，操操作作方方便便，，可可 进进行行多多次次重重复复杂杂交交。

另另外外，，在在低低离离子子强强度度条条件件下下，，也也可可与与核核酸酸牢牢固固结结合合，，因因此此适适用用于于电电转印迹法转印迹法 缺缺点点：：由由于于结结合合力力强强，，非非特特异异性性吸吸附附较较多多，，杂交信号本底较高，应注意封闭杂交信号本底较高，应注意封闭⑵⑵ 印迹方法印迹方法 转移方法不同，可分为转移方法不同，可分为①①斑斑点点或或狭狭缝缝印印迹迹，，即即直直接接将将核核酸酸样样品品点点样样于于固固相相支支持物上；持物上；②②虹虹吸吸印印迹迹法法，，利利用用毛毛细细管管虹虹吸吸作作用用，，由由转转移移缓缓冲冲液液带动核酸分子转移到固相支持物上；带动核酸分子转移到固相支持物上；③③电电转转印印迹迹法法，，即即利利用用电电场场力力的的作作用用将将核核酸酸带带到到固固相相支持物上；支持物上；④④真真空空转转移移法法，，即即利利用用真真空空抽抽滤滤作作用用，，将将核核酸酸分分子子带带到固相支持物上到固相支持物上 根据要转印核酸品种的不同，又可分为根据要转印核酸品种的不同，又可分为 Southern印迹法：是指将电泳分离的印迹法：是指将电泳分离的DNA从从凝胶中转移到固相支持物上的过程。

凝胶中转移到固相支持物上的过程 Northern印迹法：是指印迹法：是指RNA的印迹过程的印迹过程 步骤：步骤： a.DNAa.DNA分分子子经经限限制制内内切切酶酶酶酶切切酶酶切切变变成成合合适适长长度度的的DNADNA片片段段（（根根据据实实验验目目的的而而定定，，突突变变检检测测则则短短，，定定性性定定量量则则长长））一一般般理理想想的的是是0.50.5～～10Kb10Kb，，因因片片段段大大小小直直接接影影响响转转移移效率 b.b.在在琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶中中进进行行电电泳泳分分离离DNADNA片片段段，，经经EBEB（（溴溴化化乙乙锭锭））染染色色后后观观察察DNADNA片片段段大大小小，，并并与与DNADNA分分子子量量标标准准参参照照物物比比较较（（MarkerMarker））记记录录或或照照像像各各DNADNA片片段段位位置置尤尤其其留留意我们所感兴趣的意我们所感兴趣的DNADNA片段琼脂糖电泳常用于核酸，一般为水平板电泳琼脂糖电泳常用于核酸，一般为水平板电泳 SDS电泳常用于蛋白质，一般为垂直板电泳电泳常用于蛋白质，一般为垂直板电泳））SouthernSouthern印迹法印迹法 c.c.将将凝凝胶胶浸浸泡泡于于适适量量的的变变性性液液中中(1.5mol/L (1.5mol/L NaclNacl和和0.5mol/L 0.5mol/L NaOHNaOH) )室室温温1h1h，，其其目目的的使使DNADNA变变性性，，即即将将双双链链DNADNA变变成成单单链链DNADNA。

如如果果DNADNA片片段段较较大大( (大大于于15kb)15kb)，，可可在在变变性性前前，，用用稀稀盐盐酸酸（（0.2mol/L0.2mol/L））处处理理10min10min，，脱脱嘌嘌呤呤后后，，再再进进行行碱碱变变性性处处理理，，使使之之降降解解为为小小片片段段，，因因为为片片段段的的大大小小直直接接影影响响转转移速率小于移速率小于15Kb15Kb，，转移转移1h1h，，大于大于15Kb15Kb则需要则需要18h18h d.d.印印迹迹( (转转移移) )方方法法：：虹虹吸吸印印迹迹法法，，电电转转印印迹迹法法和和真真空空印印迹迹法法其其中中常常用用的的是是后后两两种种，，本本教教研研室室常常用用后后一一种种，，真真空空印印迹迹法法不不论论采采用用哪哪种种方方法法，，均均是是将将DNADNA从从凝凝胶胶转转移移到到固固相支持物上（硝酸纤维素膜、尼龙膜）相支持物上（硝酸纤维素膜、尼龙膜） e.e.固定固定，上一步骤虽然将，上一步骤虽然将DNADNA转移到固相支持物上，但转移到固相支持物上，但结合还不牢固，需进一步固定方法有：对于硝酸纤维膜，结合还不牢固，需进一步固定。

方法有：对于硝酸纤维膜，可真空下可真空下80℃80℃烘烤烘烤2h(2h(亦可无真空亦可无真空) )，对尼龙膜还可用短波，对尼龙膜还可用短波紫外线（波长紫外线（波长254nm254nm））照射几分钟进行固定，固定后方可进照射几分钟进行固定，固定后方可进行下一步的杂交行下一步的杂交  NorthernNorthern印印迹迹法法是是指指将将RNARNA变变性性及及电电泳泳分分离离后后，，将将其其转转移移到到固固相相支支持持物物上上的的过过程程从从而而可可用用于于杂杂交交反反应应以以鉴鉴定定其其中特定中特定mRNAmRNA的丰度 基基本本原原理理与与SouthernSouthern印印迹迹相相同同，，但但RNARNA变变性性方方法法与与DNADNA不不同同，，不不能能用用碱碱变变性性，，因因为为碱碱导导致致RNARNA水水解解RNARNA的的变变性性常常与与电电泳泳同同时时进进行行，，常常有有3 3种种方方法法，，即即聚聚乙乙醛醛和和二二甲甲基基亚亚砜砜变变性性电电泳泳；；甲甲醛醛变变性性凝凝胶胶电电泳泳和和甲甲基基氧氧化化汞汞电电泳泳，，常常用用的的是是第二种 NorthernNorthern印迹法印迹法 RNARNA经变性电泳后，一般可进行转移（印迹），其印经变性电泳后，一般可进行转移（印迹），其印迹方法与迹方法与SouthernSouthern方法相同。

但对含甲醛的凝胶，可用方法相同但对含甲醛的凝胶，可用DEPCDEPC预处理水漂洗，以去除甲醛如果凝胶较浓（大于预处理水漂洗，以去除甲醛如果凝胶较浓（大于1 1％）、较厚（如大于％）、较厚（如大于0.5cm0.5cm））或待测或待测RNARNA片段较大（大于片段较大（大于2.5kb2.5kb），），可预先将凝胶放在可预先将凝胶放在0.05mol/L 0.05mol/L NaOHNaOH溶液中浸泡溶液中浸泡2020分钟，以便充分使分钟，以便充分使RNARNA变性然后变性然后DEPCDEPC处理过的水漂洗，处理过的水漂洗，最后用最后用20×SSC20×SSC浸泡浸泡45min45min 固定方法，常用真空烘烤（固定方法，常用真空烘烤（8080℃））2h2h2．杂交（固－液相杂交）技术．杂交（固－液相杂交）技术 DNA分子杂交实际上是双链分子杂交实际上是双链DNA的变性和具有的变性和具有同源序列的两条单链的复性过程同源序列的两条单链的复性过程RNA分子杂交也涉分子杂交也涉及变性和复性过程（这种变性是单链及变性和复性过程（这种变性是单链RNA分子内部发分子内部发夹结构打开过程），其基本原理和方法与夹结构打开过程），其基本原理和方法与DNA杂交基杂交基本一致。

因此以本一致因此以DNA分子杂交为例进行介绍分子杂交为例进行介绍（（1）变性）变性 即打开即打开DNA双螺旋结构，变成单链双螺旋结构，变成单链DNA的过程 变性的方法有：加热变性变性的方法有：加热变性 有机溶剂变性有机溶剂变性 高浓度盐变性高浓度盐变性 碱变性等碱变性等 常用方法是加热变性和碱变性常用方法是加热变性和碱变性 DNADNA变性时，在变性时，在260nm260nm处的紫外吸光度增加，这种现象又称处的紫外吸光度增加，这种现象又称增色效应当增色效应达到最大值的增色效应当增色效应达到最大值的50%50%时温度，称熔解温度时温度，称熔解温度（（melting temperature Tmmelting temperature Tm值），值），TmTm值表明值表明DNADNA溶液中一半的溶液中一半的DNADNA双链已解离为单链，也就是说，双链已解离为单链，也就是说，TmTm值反映了值反映了DNADNA变性的程度变性的程度和难易，和难易，TmTm值越大，变性越难，反之，变性容易。

值越大，变性越难，反之，变性容易 大大多多数数DNADNA的的TmTm值值在在8585～～90℃90℃左左右右但但TmTm值值并并不不是是一一个个固固定常数，常受许多因素影响定常数，常受许多因素影响 ①①DNADNA的的碱碱基基组组成成A A：：T T碱碱基基对对只只有有两两个个氢氢链链，，而而G G：：C C碱碱基基对对有有3 3个个氢氢键键因因此此TmTm值值主主要要受受G G：：C C碱碱基基对对数数量量多多少少的的影影响响，，有一个经验公式为：有一个经验公式为： TmTm＝＝(G+C)%×0.41(G+C)%×0.41＋＋69.3 69.3 ② ②溶液的离子强度溶液的离子强度DNADNA链上的磷酸基团带负电荷，它们链上的磷酸基团带负电荷，它们之间的静电具有相互排斥作用，可导致之间的静电具有相互排斥作用，可导致DNADNA双链结构的不稳定，双链结构的不稳定，比如：在无盐的水中，比如：在无盐的水中，DNADNA在室温条件下就会变性，而加入盐在室温条件下就会变性，而加入盐后，正电荷离子可以封闭磷酸基团的负电荷，使后，正电荷离子可以封闭磷酸基团的负电荷，使DNADNA双链的稳双链的稳定性增加，定性增加，TmTm值亦会升高。

值亦会升高 ③③pHpH值，值，pHpH值在值在5 5～～9 9之间范围内，之间范围内，TmTm值变化不明值变化不明显，即显，即DNADNA双链比较稳定，在高双链比较稳定，在高pHpH值情况下，可使碱基值情况下，可使碱基失去形成氢键的能力当失去形成氢键的能力当pHpH值大于值大于11.311.3时，所有氢键时，所有氢键均被破坏，均被破坏，DNADNA完全变性这就是碱变性的原理完全变性这就是碱变性的原理 ④④变性剂：变性剂：变性剂可以干扰碱堆积力和氢键的形变性剂可以干扰碱堆积力和氢键的形成，因此可以降低成，因此可以降低TmTm值常用的变性剂是甲酰胺和脲常用的变性剂是甲酰胺和脲通常用通常用5050％的甲酰胺可以使％的甲酰胺可以使TmTm值降低值降低30℃30℃ （（2）复性）复性 变性变性DNA的两条互补单链，或两条具有同源性的两条互补单链，或两条具有同源性的单链核酸重新缔合成双链的过程，称为复性或退火的单链核酸重新缔合成双链的过程，称为复性或退火 复性并不是变性反应的一个简单逆反应过程复性的复性并不是变性反应的一个简单逆反应过程复性的过程是相当复杂的。

变性过程可以在一个极短的时间内完过程是相当复杂的变性过程可以在一个极短的时间内完成（几秒钟），而复性则需要相对较长的时间才能完成成（几秒钟），而复性则需要相对较长的时间才能完成复性的时间与碰撞机率或有效配对有关分子碰撞机率越复性的时间与碰撞机率或有效配对有关分子碰撞机率越大，复性速度越快，一开始往往错误碰撞，只有正确配对大，复性速度越快，一开始往往错误碰撞，只有正确配对才是复性的开始如果使热变性的才是复性的开始如果使热变性的DNADNA溶液迅速冷却，则只溶液迅速冷却，则只能形成一些不规则的碱基对，而不会完全恢复能形成一些不规则的碱基对，而不会完全恢复DNADNA双链结构双链结构要想使变性要想使变性DNADNA完全恢复天然的双链结构，则要在低于完全恢复天然的双链结构，则要在低于TmTm值值25℃25℃的温度下维持相当长的时间才能完成的温度下维持相当长的时间才能完成  复性的（速度）过程要受到许多因素的影响复性的（速度）过程要受到许多因素的影响 ①①DNADNA的的浓浓度度：：DNADNA浓浓度度直直接接影影响响到到DNADNA单单链链间间碰碰撞的机率，浓度越大、碰撞机率越大，复性速度越快。

撞的机率，浓度越大、碰撞机率越大，复性速度越快 ②②DNADNA的的分分子子量量：：大大分分子子量量的的DNADNA扩扩散散速速度度较较慢慢，，碰碰撞撞机机率率较较少少，，同同时时又又很很难难形形成成正正确确配配对对，，因因此此复复性性速度较慢；但一旦复性，又难于变性速度较慢；但一旦复性，又难于变性 ③③温温度度：：温温度度过过高高，，有有利利于于DNADNA变变性性而而不不利利于于复复性性；；而而温温度度过过低低，，碰碰撞撞机机率率减减少少，，一一旦旦形形成成局局部部错错误误配配对对，，又又不不易易解解离离，，难难以以继继续续寻寻找找正正确确配配对对，，因因而而使使复性速度降低；适宜的温度是较复性速度降低；适宜的温度是较TmTm值低值低15℃15℃～～25℃25℃  ④④离子强度：离子强度：离子强度过低，不利于复性离子强度过低，不利于复性 ⑤⑤pHpH值值：：pHpH值值在在5 5～～9 9范范围围内内，，不不影影响响复复性性速速度，过低或过高则影响度，过低或过高则影响 ⑥⑥DNADNA分分子子的的复复杂杂性性：：DNADNA总总量量一一定定时时，，基基因因组组越越复复杂杂，，其其中中特特定定顺顺序序的的拷拷贝贝数数就就越越少少，，互互补补顺序的浓度就越低，因而复性反应速度越慢。

顺序的浓度就越低，因而复性反应速度越慢（（3 3）杂交体系的建立要考虑以下几因素）杂交体系的建立要考虑以下几因素 ①①DNADNA浓度：浓度：DNADNA浓度越高，复性速度越快其方浓度越高，复性速度越快其方法有：加入足够的法有：加入足够的DNADNA；；尽量减少杂交的体积，一般尽量减少杂交的体积，一般以每平方厘米滤膜面积加以每平方厘米滤膜面积加5050～～100μl100μl杂交液为宜杂交液为宜 ②②DNADNA探针的长度：探针的长度：在杂交过程中，待测在杂交过程中，待测DNADNA固定固定在膜上，只有探针可以自由扩散，探针越长，扩散越在膜上，只有探针可以自由扩散，探针越长，扩散越慢慢，，变变性性越越慢慢因因此此探探针针的的长长度度不不宜宜过过长长，，一一般般以以1010～～50bp50bp（一般探针（一般探针20bp20bp） ③③离离子子强强度度：：离离子子强强度度对对变变性性影影响响较较大大一一般般常常用用5×5×或或6×SSC6×SSC（（1×SSC1×SSC为为0.15mol/L 0.15mol/L NaclNacl和和0.015mol0.015mol柠柠檬檬酸钠）。

酸钠） ④④温温度度：：温温度度对对于于杂杂交交（（复复性性））反反应应的的快快慢慢和和洗洗膜膜时时去掉非特异杂交是至关重要的因素去掉非特异杂交是至关重要的因素 一一般般认认为为杂杂交交温温度度为为：：68℃68℃（（不不含含甲甲酰酰胺胺（（作作用用：：降降低低Tm值）值））；当含）；当含5050％甲酰胺时，在％甲酰胺时，在42℃42℃进行杂交进行杂交 洗膜温度一般认为洗膜温度一般认为55℃55℃～～65℃65℃ 对对于于寡寡核核苷苷酸酸探探针针的的杂杂交交温温度度，，应应根根据据下下列列公公式式推推算算：：Tm=4℃×GTm=4℃×G：：C C对对数数量量＋＋2℃×A2℃×A：：T T对对数数量量而而杂杂交交温温度度一一般比般比TmTm值低值低5℃5℃，即，即55℃55℃ TmTm值值的的推推算算：：与与G G：：C C对对数数量量，，离离子子强强度度，，变变性性剂剂等等有有关 ⑤⑤杂交时间：杂交时间：一般应为一般应为CoT1/2的的1～～3 Yz Yz 小时小时/Cot1/2＝＝ ＝＝ 5×10X 5×10X Co＝＝单单链链DNA浓浓度度，，t1/2＝＝反反应应一一半半时时的的时时间间，，Y为为探探针针DNA的的复复杂杂性性，，即即片片段段大大小小（（Kb）），，Z为为杂杂交交体体系系的的体体积积(ml)。

经经验验杂杂交交时时间间8～～16h，，过夜 ⑥⑥减减少少或或抑抑制制非非特特性性杂杂交交一一般般在在杂杂交交前前先先进进行行预预杂杂交交，，以以便便将将非非特特异异性性DNADNA位位点点封封闭闭，，同同时时也也将将膜膜上上 非非 特特 异异 性性 吸吸 附附 位位 点点 封封 闭闭 采采 用用 鲑鲑 鱼鱼 精精 子子DNADNA（（Salmon Salmon Sperm Sperm DNADNA））或或小小牛牛胸胸腺腺DNADNA（（Calf Calf thymus thymus DNADNA））封封闭闭DNADNA非非特特异异位位点点；；采采用用DehardtDehardt氏氏液液（（含含聚聚蔗蔗糖糖400400，，聚聚乙乙烯烯吡吡咯咯烷烷酮酮和和牛牛血血清清白白蛋蛋白白）），，除除封封闭闭DNADNA非非特特异异位位点点外外，，更更主主要要封封闭闭膜膜上上非非特特异异吸吸附位点近年来采用脱脂奶粉代替附位点近年来采用脱脂奶粉代替DenhardtDenhardt氏液 ⑦⑦促促进进杂杂交交反反应应速速度度：：硫硫酸酸葡葡聚聚糖糖( (dextrandextran sulfate,Mw sulfate,Mw 500000)500000)能能促促进进DNADNA链链间间的的缔缔合合，，其其微微粒粒表表面面可可吸吸附附DNADNA探探针针分分子子，，从从而而使使DNADNA接接触触面面积积增增大大，，有有利利于于杂杂交交反反应应，，促促进进杂杂交交反反应应速速度度。

如如1010％％硫硫酸酸葡葡聚糖可使杂交反应速度提高聚糖可使杂交反应速度提高1010～～100100倍 ①①预预杂杂交交；；将将膜膜放放在在预预杂杂液液中中，，即即不不放放探探针针，，预预杂杂交交液液中中主主要要含含DehardtDehardt液液和和鲑鲑鱼鱼精精DNADNA，，主主要要是是封封闭闭膜膜上上非非特特异异性性的的杂杂交交位位点点预预杂杂交交的的温温度度和和时时间间一一般般与与杂杂交交的的温温度度和和时时间是一样的间是一样的 预杂交液：预杂交液：5ⅩSSC5ⅩSSC；； 5 Ⅹ 5 Ⅹ DenhardtDenhardt；；50mmol/L PBS50mmol/L PBS；； 0.2%SDS0.2%SDS；；500ug500ug变性鲑鱼精变性鲑鱼精DNADNA；；50%50%甲甲酰胺酰胺 ②②杂杂交交：：杂杂交交液液中中除除含含封封闭闭物物质质外外，，还还含含有有1010％％硫硫酸酸葡葡聚聚糖糖和和探探针针。

探探针针如如果果是是双双链链DNADNA，，则则需需要要进进行行变变性性处处理理：：沸沸水水中中加加热热5min5min，，然然后后迅迅速速置置冰冰浴浴中中（（防防止止蛋蛋白白酶酶作作用用））；；也也可可用用碱碱变变性性处处理理探探针针是是寡寡核核苷苷酸酸片片段段、、单单链链DNADNA或或RNARNA，，则则不需要进行变性处理不需要进行变性处理 （（4 4）杂交操作步骤）杂交操作步骤 将将探探针针加加到到杂杂交交液液中中，，然然后后与与膜膜上上的的待待测测核核酸酸进进行行杂杂交交反反应应温温度度68℃68℃（（不不含含甲甲酰酰胺胺）），，42℃42℃（（含含5050％％甲甲酰胺），杂交时间：酰胺），杂交时间：8 8～～16h16h过夜 ③③洗洗液液：：洗洗膜膜过过程程是是将将膜膜上上未未与与DNADNA杂杂交交的的及及非非特特异异性性杂杂交交的的探探针针从从膜膜上上洗洗去去的的过过程程由由于于非非特特异异性性杂杂交交的的杂杂交交体体稳稳定定性性较较低低，，解解链链温温度度较较低低，，在在一一定定的的温温度度下下，，非非特特异异杂杂交交体体容容易易解解链链而而被被洗洗掉掉，，而而特特异异性性杂杂交交体体由由于于稳定而保留在滤膜上。

稳定而保留在滤膜上 注意，洗膜液要换几次，要用几种不同的洗膜液注意，洗膜液要换几次，要用几种不同的洗膜液离子强度逐渐降低，而洗膜温度逐渐上升（室温～离子强度逐渐降低，而洗膜温度逐渐上升（室温～37℃37℃～～65℃65℃）即逐渐增加洗膜的强度逐渐减少离子强度，）即逐渐增加洗膜的强度逐渐减少离子强度，为下一步反应（检测）做好准备为下一步反应（检测）做好准备 3．杂交信号的检测．杂交信号的检测 ⑴⑴放射自显影：放射自显影：探针标记了放射性核素，如探针标记了放射性核素，如32P、、35S、、125I或或131I其具体方法是：在暗盒里其具体方法是：在暗盒里将杂交后的滤膜放在暗盒里的将杂交后的滤膜放在暗盒里的X光片上，盖上暗光片上，盖上暗盒，置－盒，置－70℃曝光一定时间放射线可使曝光一定时间放射线可使X光片光片曝光，经显影、定影后，可出现黑色曝光斑点，曝光，经显影、定影后，可出现黑色曝光斑点，根据斑点密度及大小，判断被检测核酸是否有与根据斑点密度及大小，判断被检测核酸是否有与探针相应序列及大小探针相应序列及大小 ⑵⑵显色反应：显色反应：探针直接标记酶或间接结合酶，酶在有探针直接标记酶或间接结合酶，酶在有特异性底物存在的情况下，可发生显色反应。

一般情况下，特异性底物存在的情况下，可发生显色反应一般情况下，大都是通过间接法结合酶即探针标记了半抗原，如地高大都是通过间接法结合酶即探针标记了半抗原，如地高辛或生物素，再抗地高辛的抗体或抗生物素蛋白的配体辛或生物素，再抗地高辛的抗体或抗生物素蛋白的配体（（avidin））结合酶，酶在有底物存在的情况下再发生显色结合酶，酶在有底物存在的情况下再发生显色反应即即: : A B C 酶酶+底物底物 显色显色探探针针标记物标记物(地高辛地高辛)抗抗体体 根据显色反应斑点大小判断结果根据显色反应斑点大小判断结果 常用的酶常用的酶碱性磷酸酶碱性磷酸酶：：作用底物有：作用底物有：BCIP（（5-溴溴-4-氯氯-4-吲哚磷酸）吲哚磷酸） NBT(硝基蓝四氮唑硝基蓝四氮唑)显色过程：碱性磷酸酶显色过程：碱性磷酸酶 → → BCIP → → 脱磷，产生脱磷，产生H+ → → NBT还原还原 → → 紫色化合物紫色化合物辣根过氧化物酶（辣根过氧化物酶（HRP））：常用的底物：常用的底物：DAB（（二氨基联苯胺）二氨基联苯胺） TMB（（四甲基联苯胺）四甲基联苯胺） DAB经经HRP消化产生红棕色，有致癌性。

消化产生红棕色，有致癌性TMB 经经HRP消化产生蓝色，无致癌性常用后者消化产生蓝色，无致癌性常用后者⑶⑶化学发光反应化学发光反应 与显色反应基本一致，只是酶（与显色反应基本一致，只是酶（HRP碱性磷碱性磷酸酶）催化一种特殊底物如酸酶）催化一种特殊底物如luminol、、CSPD等，等，产生发光，而不显色该化学光可使产生发光，而不显色该化学光可使X光片曝光，光片曝光，经显影、定影后，可获得杂交斑点化学发光是经显影、定影后，可获得杂交斑点化学发光是一种有发展前途的检测方法如需准确定性和定一种有发展前途的检测方法如需准确定性和定量，可用数字成像系统进行检测量，可用数字成像系统进行检测（三）、（三）、PCR技术技术 1985年美国的年美国的Kary Mullis教授首次建教授首次建立了立了PCR技术，技术，1993年年Kary Mullis教授教授因此获得了诺贝尔奖因此获得了诺贝尔奖 1. PCR的定义及意义的定义及意义 定义：定义：PCR是是polymerase chain reaction 的缩写，的缩写， 译为多聚酶链式反应。

是一种在体外（试管内）译为多聚酶链式反应是一种在体外（试管内） 扩增扩增DNA特异片段的技术，可在短时间内获得特异片段的技术，可在短时间内获得 大量（数百万个）大量（数百万个）DNA特异序列的拷贝特异序列的拷贝 意义：意义：可在短时间内获得大量目的基因，因此比较容可在短时间内获得大量目的基因，因此比较容 易地对目的基因进行分析、鉴定及其他用途易地对目的基因进行分析、鉴定及其他用途 要想从生物材料中获得某一特异要想从生物材料中获得某一特异DNADNA片段，按传片段，按传统的方法，要采用重组和克隆技术，不仅费时（数统的方法，要采用重组和克隆技术，不仅费时（数周甚至数月），而且获得的数量有限周甚至数月），而且获得的数量有限PCRPCR技术不仅技术不仅克服了上述缺点，而且还有灵敏度高的优点，只要克服了上述缺点，而且还有灵敏度高的优点，只要微量的微量的DNADNA（（一滴血，精斑，头发），就可以得到大一滴血，精斑，头发），就可以得到大量扩增的量扩增的DNADNA 概括起来，概括起来， PCR的特点是：的特点是： ①①简单、快速。

简单、快速 ②②需要样本量很少，即灵敏度高需要样本量很少，即灵敏度高 2. PCR技术的原理技术的原理 PCR技技术术实实际际上上是是根根据据DNA复复制制的的基基本本原原理理，，建建立立起起来来的的一一种种体体外外DNA复复制制方方法法，，即即在在模模板板DNA、、引引物物和和4种种脱脱氧氧核核糖糖核核苷苷酸酸存存在在的的条条件件下下，，靠靠DNA聚聚合合酶酶催催化化反反应应，，合合成成一一条条与与模模板板互互补补的的新新链链它它与与体体内内DNA复复制制不不同同的的是是，，要要不不断断改改变变温温度度，，即即通通过过温温度度控控制制来来实实现现聚聚合合反反应步骤步骤 （（1））变变性性（（denaturation））：：通通过过加加热热使使DNA双双螺螺旋旋的氢键断裂，形成单链的氢键断裂，形成单链DNA2））退退火火（（annealling））：：当当温温度度突突然然降降低低到到适适当当温温度度时时，，引引物物与与DNA模模板板上上的的特特异异序序列列，，按按碱碱基基互互补补原原则，形成杂交双链则，形成杂交双链3））延延伸伸（（extension））：：在在DNA聚聚合合酶酶、、4种种脱脱氧氧核核糖糖核核苷苷三三磷磷酸酸及及Mg2+存存在在条条件件下下，，以以引引物物为为起起始始点点，，按按5′→→3′方向催化合成一条与模板互补的新链。

方向催化合成一条与模板互补的新链 以以上上三三个个步步骤骤为为一一个个循循环环，，每每一一个个循循环环产产物物可可以以作作为为下下一一个个循循环环的的模模板板，，数数小小时时之之后后，，介介于于两两个个引引物物之之间间特特异异性性DNA片片段段得得到到了了大大量量复复制制，，数数量量可可达达2×106～～2×107拷拷贝贝，，即即是是指指数数增增长长其其中中，，引引物物是是延延伸伸反反应应的的诱诱导导物物，，同同时时又是特异性扩增的关键又是特异性扩增的关键3.PCR的反应体系及反应条件的反应体系及反应条件 PCR反应体系反应体系 反应体系一般选用反应体系一般选用50μl～～100μl体积，其中含有：体积，其中含有：（（1））PCR缓冲液：缓冲液：50mmol/L KCl；；10mmol/L Tris·HCl (pH8.4)；；1.5mmol/L MgCl2；；100μg/ml 明胶或牛血清白蛋白（明胶或牛血清白蛋白（BSA）2））2个引物，各个引物，各0.25μmol/L3））4种底物种底物dNTP，，各各200μmol/L4））模板模板DNA（（人类基因组人类基因组DNA））0.1μg。

5））Taq DNA聚合酶，聚合酶，2.5u（（国际单位）国际单位）反应条件：反应条件： 94℃94℃变性变性3030秒；秒； 55℃55℃退火退火3030秒；秒； 70℃70℃～～72℃72℃延伸延伸3030～～6060秒；秒； 共共3030次左右的循环次左右的循环 4. PCR反应体系中各种成分的作用、用量反应体系中各种成分的作用、用量⑴⑴ KCl：：促促进进引引物物退退火火，，使使用用量量为为50 mmol/L，，过过低低，，不起作用；过高则抑制不起作用；过高则抑制Taq DNA聚合酶活性聚合酶活性⑵⑵ MgCl2：：Mg2+能能影影响响反反应应的的特特异异性性和和扩扩增增速速度度、、产产量比较合适的用量为量比较合适的用量为1.5 mmol/L～～2.0mmol/L⑶⑶ 明明胶胶和和BSA 对对Taq DNA聚聚合合酶酶有有一一定定保保护护作作用用（（尤尤其高温变性时）其高温变性时） ⑷⑷ Tris·HCl：：调调节节PH值值并并起起缓缓冲冲作作用用，，Taq DNA聚聚合合酶酶发发挥挥作作用用需需要要一一个个偏偏碱碱环环境境（（pH8.4）），，Tris·HCl就起到这样的一个作用。

就起到这样的一个作用 ⑸⑸ 底底物物（（脱脱氧氧核核糖糖核核苷苷三三磷磷酸酸，，dNTPs））：：合合成成新新链链DNA的的底底物物（（前前体体物物，，原原料料））在在PCR反反应应中中，，dNTP浓度应在浓度应在20μmol/L～～200μmol/L dNTP溶溶液液具具有有较较强强的的酸酸性性，，使使用用时时应应用用NaOH将将pH值值调调至至7.0～～7.5另另外外，，4种种脱脱氧氧核核糖糖核核苷苷三三磷磷酸的浓度要相等酸的浓度要相等 ⑹⑹ Taq DNA聚聚合合酶酶：：催催化化底底物物合合成成DNA新新链链该该酶酶具具有有很很强强的的耐耐热热性性（（经经95℃持持续续高高温温仍仍不不变变性性、、失失活活）），，因因此此，，加加一一次次酶酶可可完完成成整整个个PCR反反应应在在100μl反反应应体体系系中中，，一般需要一般需要Taq DNA聚合酶的用量为聚合酶的用量为0.5u～～5u ⑺⑺ 引引物物：：与与目目的的基基因因的的特特异异序序列列结结合合，，并并引引导导新新链链DNA的的合合成成PCR之之所所以以可可对对特特异异DNA序序列列进进行行扩扩增增，，关关键键在在于于引引物物，，即即引引物物决决定定要要对对哪哪一一段段基基因因进进行行扩扩增增。

在在PCR反反应应体体系系中中，，引引物物浓浓度度一一般般为为0.1μmol/L～～0.5μmol/L引引物物浓浓度度过过高高，，可可引引起起非非特特异异性性扩扩增增，，且且可可增增加加引引物物之之间间形成二聚体的机率引物浓度过低，形成二聚体的机率引物浓度过低，DNA合成率也会下降合成率也会下降 5. PCR反应的几个关键因素反应的几个关键因素 （（1）） 高温变性、低温退火、中温延伸高温变性、低温退火、中温延伸 高高温温变变性性：：一一般般在在90℃～～95℃条条件件下下，，任任何何复复杂杂的的DNA均均可可变变性性因因此此高高温温变变性性的的温温度度容容易确定、选择易确定、选择 中中温温延延伸伸：：一一般般以以Taq DNA聚聚合合酶酶发发挥挥活活性性作作用用的的最最适适宜宜温温度度为为延延伸伸反反应应温温度度Taq DNA聚聚合合酶酶的的最最适适温温度度为为70℃～～75℃之之间间因因此此，，中温延伸温度也比较容易确定中温延伸温度也比较容易确定 低低温温退退火火：：低低温温退退火火时时，，引引物物与与模模板板上上的的特特异异序序列列结结合合，，而而模模板板两两个个单单链链DNA不不易易结结合合。

因因为为引引物物是是较较小小的的片片段段，，与与模模板板碰碰撞撞机机会会大大，，易易于于结结合合而而两两个个单单链链DNA由由于于分分子子片片段段较较大大，，不不易易碰碰撞撞结结合合退退火火温温度度的的选选择择，，一一方方面面要要考考虑虑引引物物与与模模板板DNA的的特特异异性性结结合合，，另另一一方方面面又又要要考考虑虑防防止止模模板板DNA的的两两条条单单链链的的结结合合温温度度偏偏高高，，有有利利于于引引物物与与模模板板之之间间的的特特异异性性结结合合，，但但反反应应产产物物减减少少；；偏偏低低，，容容易易引引起起引引物物与与模模板板之之间间的的非非特特异异性性结结合合，，并并引引起起模模板板两两条条DNA的的结结合合因因此此，，退退火火温温度度的的选选择择至至关关重重要要引引物物长长度度在在15bp～～25bp之之间间时时，，Tm=4×G/C+2×A/T退退火火温温度度的的选选择择应应在在Tm值值允允许许范范围围内内，，尽尽量量选选择择较较高温度一般为高温度一般为40℃～～60℃，以，以55℃为常用温度为常用温度 是是从从一一种种在在火火山山温温泉泉中中生生长长的的细细菌菌中中分分离离得得到到的的。

该该细细菌菌生生长长在在70℃～～75℃极极富富矿矿物物质质的的环环境境中中，，因因此此该该酶酶具具有有很很强强的的耐耐热热性性和和耐耐盐盐性性 在在 92.5℃、、 95℃、、 97.5℃条条 件件 下下 ，， Taq DNA聚聚合合酶酶的的半半衰衰期期分分别别为为130min、、40min和和5min～～6min因因此此，，该该酶酶发发挥挥生生物物学学活活性性所所需需要要的的温温度度亦亦也也较较高高，，70℃～～75℃时时具具有有最最高高的的生物活性生物活性2）） Taq DNA聚合酶：聚合酶： Mg2+对对该该酶酶活活性性影影响响较较大大，，适适当当浓浓度度Mg2+可可保保证证该该酶酶活活性性达达到到最最大大作作用用偏偏高高，，可可抑抑制制酶酶活活性性，，由由于于Mg2+可可与与DNA磷磷酸酸基基团团结结合合，，因因此此，，DNA模模板板、、引引物物、、dNTP均均可可与与Mg2+结结合合，，从从而而影影响响Mg2+发发挥挥作作用用，，因因此此MgCl2浓浓度度在在PCR反反应应体体系系中中要要适适当当进进行行调调整整一一般般Mg2+浓浓度度至至少少应应比比dNTP总总浓浓度度高高出出0.5 mmol/L～～1.0 mmol/L。

另另外外，，注注意意：：KCl最最适适浓浓度度是是50 mmol/L过过高高，，对此酶有抑制作用对此酶有抑制作用（（3））引物：引物： 要要想想对对生生物物样样品品中中某某一一段段DNA进进行行扩扩增增，，必必须须根根据据该该段段DNA中中的的某某一一特特异异序序列列，，设设计计引引物物，，因因为为只只有有在在引引物物的的引引导导下下，，才才能能合合成成新新的的DNA链链因因此此引物的设计特别关键引物的设计特别关键 引物设计的原则是：引物设计的原则是： （（1 1））特特异异性性，，只只能能与与待待扩扩增增DNADNA的的某某一一特特异异序序列列结结合合；；与与非非扩扩增增区区的的同同源源不不应应超超过过7070％％，，或或连连续续有有8 8个个互互补补碱碱基基因同源 （（2 2））引引物物长长度度以以1515～～30bP30bP为为宜宜，，一一般般为为2020～～27bP27bP，，最最长长不不能能超超过过38bP38bP，，因因为为超超过过38bP38bP时时，，最最适适延延伸伸温温度度会会超过超过Tag DNATag DNA聚合酶的最适温度。

聚合酶的最适温度 （（3 3））G G＋＋C C含含量量应应在在4040～～6060％％，，因因为为G G＋＋C C直直接接影影响响引引物与模板结合的牢固性物与模板结合的牢固性 （（4 4））引引物物碱碱基基尽尽可可能能随随机机分分布布，，避避免免出出现现嘌嘌呤呤、、嘧嘧啶啶堆堆积积现现象象尤尤其其3’3’－－端端不不应应超超过过3 3个个连连续续的的G G或或C C因因为这样会使引物在为这样会使引物在GCGC富集区发生错误配对富集区发生错误配对 （（5 5））引引物物内内部部不不应应形形成成二二级级结结构构，，两两个个引引物物之之间间尤尤其在其在3’3’－端不应有互补链存在－端不应有互补链存在 （（6 6））引引物物的的3’3’－－端端碱碱基基，，是是延延伸伸反反应应起起始始位位点点，，不不能能加加任任何何修修饰饰原原则则上上要要求求一一定定要要与与模模板板DNADNA配配对对3’3’－－末末端端的的碱碱基基最最好好选选A A、、C C、、G G，，而而不不选选T T，，否否则则易易发发生生错错误配对 （（7 7）引物的）引物的5’5’端，端，限定着限定着PCRPCR产物的长度。

它对扩产物的长度它对扩增的特异性影响不大，所以对引物的增的特异性影响不大，所以对引物的5’5’－端不需严格控－端不需严格控制只要引物与制只要引物与DNADNA模板的结合长度足够，模板的结合长度足够，5’5’－端碱基－端碱基可以不与模板结合而呈游离状态（可以不与模板结合而呈游离状态（1010个碱基游离，并不个碱基游离，并不影响影响PCRPCR反应）另外反应）另外5’5’－端可以进行修饰；加酶切位－端可以进行修饰；加酶切位点；标记生物素、地高辛点；标记生物素、地高辛、、荧光素等以利于对扩增产荧光素等以利于对扩增产物的检测物的检测 6. PCR技术的应用技术的应用 （（1 1）疾病的基因诊断）疾病的基因诊断 ①①根据特异性扩增带作出诊断根据特异性扩增带作出诊断 a.基基因因缺缺失失遗遗传传性性疾疾病病，，如如地地中中海海贫贫血血，，正正常常基基因因组组有有136bp长长片片段段，，而而地地中中海海贫贫血血患患者者的的基基因因组组中中缺缺失失（（没没有有））这这一一片片段段因因此此用用PCR扩扩增增时时，，正正常常人人可可以以扩扩增增出出这这一一片片段段，，而而患患病病者者没没有有这这一一片片段段，，据据此此可可作作出出诊诊断。

断 b.特特异异性性基基因因片片段段，，主主要要对对病病原原体体感感染染性性疾疾病病作作出出诊诊断断病病原原体体包包括括病病毒毒（（爱爱滋滋病病、、肝肝炎炎病病毒毒等等））、、细细菌菌和和支支原原体体等等其其原原理理是是根根据据病病原原体体的的特特异异基基因因片片段段（（即即只只有有该该病病原原体体才才有有该该基基因因片片段段））设设计计引引物物，，然然后后对对该该特特异异性性基基因因片片段段进进行行扩扩增增，，如如果果扩扩增增出出来来，，说说明明有有该该病病原原体体存存在在，，否否则则就就不不存存在在这这里里关关键键技技术术在在于于两两点点：：首首先先是是一一定定要要找找到到该该病病原原体体的的特特异异性性基基因因片片段段，，该该基基因因片片段段在在其其它它生生物物体体中中不不存存在在该该基基因因的的存存在在就就能能代代表表该该病病毒毒；；二二是是所所设设计计的的引引物物只只能能专专一一地地对对该该基基因因片片段段互互补补，，而而对对宿宿主主或或其其它它生生物物的的基基因因没没有有互互补补，，这这样样才才能能保保证证扩扩增增的的特异性 ②②根根 据据 限限 制制 酶酶 片片 段段 长长 度度 多多 态态 性性 （（ restriction fragment length polymorphism, RFLP））作作出出诊诊断断。

直直接接利利用用PCR作作出出疾疾病病诊诊断断，，只只限限于于上上述述两两种种情情况况，，即即基基因因缺缺失失和和特特异异性性基基因因片片段段，，而而对对于于基基因因突突变变（（只只涉涉及及几几个个碱碱基基改改变变）），，直直接接利利用用PCR方方法法无无法法做做出出诊诊断断，，因因此此，，采采用用PCR结结合合限限制制性性酶酶切切方方法法作作出出诊诊断断其其原原理理是是：：碱碱基基突突变变往往往往会会产产生生新新的的或或消消除除原原有有的的内内切切酶酶位位点点而而某某一一些些酶酶切切位位点点的的改改变变又又常常常常与与一一些些疾疾病病（（遗遗传传性性疾疾病病、、癌癌症症及及心心脏脏血血管管疾疾病病））有有密密切切联联系系因因此此可可根根据据新新产产生生的的酶酶切切位位点点，，或或原原有有酶酶切切位位点点的的消消除除，，而而引引起起酶酶切切后后片片段段长长度度或或数数目目的的改改变变，，来来对对疾疾病病作作出出诊诊断断即即先先进进行行PCR扩扩增增，，然然后后进进行行酶酶切切，，最最后后进行电泳，根据是否发生条带数目的改变，作出诊断进行电泳，根据是否发生条带数目的改变，作出诊断 ③③PCR结结合合特特异异寡寡核核苷苷酸酸探探针针（（ASO））斑斑点点杂杂交交进进行行诊诊断断。

绝绝大大多多数数基基因因突突变变，，并并没没有有涉涉及及酶酶切切位位点点的的变变化化，，因因此此无无法法用用RFLP进进行行分分析析对对于于这这种种情情况况可可采采用用寡寡核核苷苷酸酸探探针针对对PCR产产物物进进行行斑斑点点杂杂交交其其原原理理是是：：用用PCR将将包包含含突突变变点点的的基基因因片片段段扩扩增增出出来来，，然然后后针针对对各各种种基基因因突突变变合合成成一一系系列列具具有有正正常常序序列列和和突突变变序序列列的的寡寡核核苷苷酸酸片片段段，，经经标标记记后后作作为为探探针针，，严严格格控控制制杂杂交交和和洗洗膜膜条条件件，，使使探探针针与与待待测测DNA序序列列间间只只要要有有一一个个碱基错配就不能杂交上，根据杂交情况进行诊断碱基错配就不能杂交上，根据杂交情况进行诊断(2)PCR在法医学上的应用在法医学上的应用 用用PCR扩扩增增DNA，，然然后后检检测测DNA的的多多态态性性，，由由于于每每个个个个体体的的多多态态性性不不同同，，所所以以借借此此可可以以进进行行个个体识别和亲子鉴定体识别和亲子鉴定 DNA多多态态性性一一般般分分为为两两类类，，一一类类是是序序列列多多态态性性，，一类是长度多态性。

一类是长度多态性 序序列列多多态态性性常常用用PCR扩扩增增后后直直接接测测序序或或用用寡寡核核苷酸探针杂交从而进行检测苷酸探针杂交从而进行检测 长度多态性，长度多态性，PCR扩增后，进行凝胶电泳分析，扩增后，进行凝胶电泳分析，或结合特异性探针杂交，则得出结论更可靠或结合特异性探针杂交，则得出结论更可靠 (3)PCR在分子生物学中的其它应用在分子生物学中的其它应用 ①①克克隆隆：：扩扩增增目目的的基基因因，，将将目目的的基基因因连连接接到到质质粒粒上上为为了了达达到到能能与与质质粒粒相相连连，，引引物物的的5′端端可可做做一一些些修修饰饰：：如如加加一一个个限限制制性性酶酶切切位位点点序序列列，，或或加加一一个个启动子（为了研究表达），引入点突变等启动子（为了研究表达），引入点突变等 ②② DNA序列的测定：一般两次序列的测定：一般两次PCR扩增后，直扩增后，直接测序；或接测序；或PCR后，将后，将PCR产物克隆到质粒上再进产物克隆到质粒上再进行测序  ③③基基因因的的定定量量：：在在同同一一反反应应试试管管中中，，同同时时加加入入待待测测模模板板DNA和和参参照照DNA片片段段，，参参照照DNA片片段段基基本本上上按按待待测测DNA的的方方式式进进行行构构建建，，只只是是在在其其基基础础上上增增加加了了一一段段内内部部连连接接顺顺序序。

其其目目的的是是使使两两种种DNA片片段段的的扩扩增增产产物物可可在在凝凝胶胶电电泳泳上上分分开开））在在相相同同引引物物的的作作用用下下，，同同步步扩扩增增理理论论上上扩扩增增倍倍数数应应是是相相同同的的，，根根据据开开始始时时参参照照DNA的的浓浓度就可推算待测度就可推算待测DNA的浓度 如如果果应应用用该该方方法法进进行行mRNA检检测测，，首首先先应应将将mRNA在在逆逆转转录录酶酶的的作作用用下下，，反反转转录录成成cDNA，，然然后后再再进进行行PCR反反应应，，该该方方法法又又叫叫RT-PCR（（反反转转录录PCR））主主要要是是对对基基因表达量的检测因表达量的检测 是由是由Peng Liang和和Strauss于于1992年首先提出年首先提出的，这一技术是从的，这一技术是从mRNA水平研究哺乳动物不同水平研究哺乳动物不同基因组之间表达差异的基因组之间表达差异的PCR反应，是一种能全面反应，是一种能全面筛选组织细胞特异性表达基因的方法，也是目前筛选组织细胞特异性表达基因的方法，也是目前筛选差异表达基因最有效的方法之一筛选差异表达基因最有效的方法之一 7.差异显示差异显示PCR技术技术(differential display PCR, DD-PCR) 对照组对照组 处理组处理组mRNAmRNA或总或总RNA mRNARNA mRNA或总或总RNARNA ↓——— ↓——— 反转录反转录———↓———↓ cDNAcDNA cDNAcDNA ↓ PCR ↓ PCR ↓ PCR ↓ PCR 扩增产物扩增产物 扩增产物扩增产物 ︱︱ ︱︱ ↓ ↓电泳分离、比较电泳分离、比较 切下差异显示条带切下差异显示条带 ↓ ↓ PCRPCR 克隆、杂交、测序克隆、杂交、测序 ↓ ↓ GemebankGemebank 确定相关基因确定相关基因DD-PCR 流流 程程 图图 将真核细胞中所有表达的基因将真核细胞中所有表达的基因(15000个个)均检均检测出来测出来,看看表达是否有差异。

看看表达是否有差异PCR引物的设计是引物的设计是关键，关键，mRNA 3-端末端均有端末端均有poly A,将将引物设计成引物设计成T12MN，，M、、N代表四种碱基的一种，但代表四种碱基的一种，但M不能是不能是T，，共共12种引物5′ 端采用端采用20条随机引物，每条引物条随机引物，每条引物由由1010个碱基组成个碱基组成基本思想基本思想1.理论上，该方法能够使细胞的每一条理论上，该方法能够使细胞的每一条mRNA 均有扩增机会，故可同时检测其全部基因表达均有扩增机会，故可同时检测其全部基因表达2.可同时进行多组间样本的比较分析可同时进行多组间样本的比较分析3.可同时检测基因的上调或下调可同时检测基因的上调或下调4.可发现新基因可发现新基因优优 点点  假阳性率高，高达假阳性率高，高达70%，主要是引物设计问，主要是引物设计问题，由于引物设计靠近了一端，而题，由于引物设计靠近了一端，而3’端往往又不端往往又不通过翻译区，所扩增的片段不是基因全部，所以通过翻译区，所扩增的片段不是基因全部，所以往往在基因库找不到相关基因往往在基因库找不到相关基因缺缺 点点应应 用用 DD-PCR是消减杂交的一种变换方式，具有是消减杂交的一种变换方式，具有简便、快速、所需起始材料少、可快速地对多个简便、快速、所需起始材料少、可快速地对多个样本进行比较，非常适合用于对处于疾病不同发样本进行比较，非常适合用于对处于疾病不同发展阶段或处于不同发育阶段的生物样本进行比较展阶段或处于不同发育阶段的生物样本进行比较研究。

该方法用于分子营养学方面的研究，可以研究该方法用于分子营养学方面的研究，可以搜寻同一营养相关疾病的不同发展阶段或不同亚搜寻同一营养相关疾病的不同发展阶段或不同亚型之间，或病变组织与正常组织之间的差异型之间，或病变组织与正常组织之间的差异EST，，进而发现新的营养相关基因进而发现新的营养相关基因DD-PCR可以直可以直观地在整个观地在整个mRNA水平展示出营养相关基因在表水平展示出营养相关基因在表达上所发生的各种变异达上所发生的各种变异谢谢 谢谢。