蛋白质晶体结构解析课堂PPT.ppt

蛋白质晶体结构解析蛋白质晶体结构解析1 1. 蛋白质结构解析技术X射线晶体衍射核磁共振（NMR）电镜技术核磁共振技术不需要获得生物大分子的晶体,适用于均一稳定的、分子量在30 kD 以下的生物大分子溶液，并且能够提供生物大分子的动力学信息近年来电镜尤其是单颗粒冷冻电镜三维重构技术的发展使得人们能够更方便地研究分子量在 150 kD 以上的生物大分子，其分辨率能够到达 3 Å~4 ÅX射线晶体学可以通过测定蛋白质分子在晶体中电子密度的空间分布，在一定分辨率下解析蛋白质中所有原子的三维坐标2 专门存储蛋白质和核酸分子结构的蛋白质数据库中，接近90%的蛋白质结构是用X射线晶体学的方法测定的 大约9%的已知蛋白结构是通过核磁共振技术来测定的该技术还可用于测定蛋白质的二级结构 冷冻电子显微技术是近年来兴起的一种获得低分辨率（低于5埃）蛋白质结构的方法，该方法最大的优点是适用于大型蛋白质复合物（如病毒外壳、核糖体和类淀粉蛋白纤维）的结构测定32. 数据收集3. 相位的测定4. 相位的优化5. 电子密度图的解释6. 修正2. X射线晶体衍射法 测定蛋白质结构的基本过程1.蛋白质结晶4 利用X射线晶体学测定蛋白质的三维结构,首先需要得到适合于结构分析的蛋白质晶体，其需要满足两个条件:2.12.1蛋白质结晶蛋白质结晶(1)晶体内部结构要具有有序性，只能是单晶，不能是孪晶，因为孪晶的两个晶体的衍射图样间的干涉和重叠而无法得到具有结构本身特点的衍射图样。

2)晶体要有一定的大小和形状，因为晶体衍射线的强度大体上正比于晶体的体积，而反比于相对分子质量的大小5 气相扩散技术的悬滴法此法是使任何挥发性的组分在小液滴和大样品池间达到平衡，使蛋白质液滴中沉淀剂及蛋白质的浓度逐渐增加，达到过饱和的状态，最终析出晶体微量透析法微量批处理法62.22.2衍射数据的收集衍射数据的收集 收集衍射数据通常是利用单波长的X射线光束照射在一定角度范围内旋转的蛋白质晶体，同时记录晶体对X射线散射的强度这些强度可转换为结构测定中的结构因子的振幅 一套好的衍射数据是晶体结构分析的基础，衍射数据的好坏直接涉及结果的精密而一套好的衍射数据又与晶体的好坏、X射线源的强度以及收集数据的仪器和方法有关 目前通常采用的X射线源有两类，一类是阳极靶式包括封闭管式和旋转阳极靶式，另一类是同步辐射X射线源7 无论哪种形式，都要求X射线源的辐射密度尽量大，即单位面积的光强大对同一晶体来说，只要蛋白质对辐射有一定的耐受力否则在收数据的过程中需要更换晶体，X射线源的强度越高，晶体的衍射强度也就越大，数据的误差也就越小各种X射线源的光强大小关系是：X射线源封闭管的光强最弱,转靶X射线源的强度约为封闭管的一倍，同步辐射光强约为封闭管的一倍。

除此之外，还要求X射线的发散度尽量小，这一点上同步辐射同样优于阳极靶式的X衍射仪X射线源出来的射线经过单色器滤波片和准直器后，就可以得到单波长的X射线直线光束8 有了准备好的蛋白质晶体和单波长的X射线直线光束，就可以记录衍射数据了，数据收集方法主要有衍射仪法、回摆法、白光辐射法 目前主要采用的是回摆法来记录衍射数据回摆法的特点是可以同时收集衍射空间的三维数据，因而同时记录更多的衍射数据，并缩短收集衍射强度的时间9晶胞中分子堆积的这类基本信息对解决一些疑难的相位问题会有很大的帮助，下面分别介绍获得相位信息的3种主要方法:2.32.3相位的测定相位的测定 在晶体中一个不对称单元中有多个相同的蛋白质分子时，一些有价值的分子之间堆积的信息可直接从结构振幅计算得出，而不必要预先知道任何相位信息102.3.1单对或多对同晶置换法 同晶置换法是由20世纪50年代发现的可以用于求解蛋白质相位信息的方法当蛋白质晶体中引入了适当的重原子后，就造成该晶体衍射线强度的差别，从衍射强度的差别就可能推导出相位信息11 在蛋白质晶体中包含大约30％-50％的水，蛋白质大分子在晶体中作有规则的周期排列，大分子之间存在不少通道，通常在这些通道中填满着水分子或结晶母液中的其他溶剂分子。

因此，如果把蛋白质晶体浸泡在某种金属离子或含有重原子的小分子的溶液中，重原子有可能通过这些通道进入蛋白质晶体内，并置换晶胞中某些位置上的溶剂分子这种置换一般不会引起大分子结构以及整个晶体结构的明显变化，从而形成较好的同晶置换体122.3.2分子置换法 不同的分子结构会导致不同的衍射图样，或者说衍射强度的分布特点换句话说，在分子排列以及分子结构上完全相同或类似的晶体在衍射图样上也必然出现相同或类似的特征因此，假如有两个分子结构上相同或相似，但具有不同晶型的晶体而其中一个晶体结构已经测定，那么根据上述原理从原则上可以设法由已知晶体结构来推引出未知晶体结构或类似分子在不同晶胞中的取向和位置，从而得到分子结构的初始模型解决这一类结构问题的方法称为分子置换法13这个过程可以分为两步：旋转（rotation）和平移（translation）在旋转步骤中，将计算并决定已知蛋白与未知蛋白在空间上的相对取向在平移过程中，需要通过计算将已知蛋白结构平移到与未知蛋白一致的位置其过程如图所示：14152.3.3反常散射法 当入射的光子的能量足够高的时候，尤其是射线的波长接近原子的吸收限时，射线的入射光子会激发电子到激发态，这部分受激电子跃迁回低能态时将释放光子，这部分荧光的相位比原来的相位有所延迟，这种现象称为反常散射。

利用反常散射法解析蛋白质晶体结构，要求蛋白质分子中有一个金属原子和波长可调的同步辐射加速器X射线源，结果基本等同于完美的同晶置换法此法在金属蛋白中广泛使用162.42.4相位的优化相位的优化 从实验数据中得到了结构因子的振幅强度，然后通过各种方法得到了结构因子的相位，有了振幅和相位就可以通过变化计算出电子密度图电子密度图是晶体结构分析的直接结果，它包含了结构的全部信息17 溶剂扁平化法是基于误差扰动产生的蛋白质“溶剂”区应该到处都一样的原理使用这个方法的关键是要找出蛋白质和“溶剂”区的交界面，需要预先告知程序晶体的含水量，这样等相关程序会自动抹平“溶剂”区这一步骤可通过程序反复多次，直到计算电子密度图的相位收敛为止18 相位确定后，可开始计算电子密度图若从电子密度图能跟踪出肽链走向和分辨出二级结构，如基于高分辨率的数据通常这意味着衍射数据的分辨率至少达到0.35 nm)，则可能推出多肽链的三维折叠方式进而根据氨基酸序列，就可能构建出原子坐标形式的蛋白质结构模型2.52.5电子密度图的解释电子密度图的解释2.6 2.6 修正修正 考虑到已建立的立体化学资料(如键长，键角等)的限制，根据X射线衍射数据对初始的蛋白质分子模型进行修正。