反义核酸技术及其在寄生虫学中的应用进展.doc

1反义核酸技术及其在寄生虫学中的应用进展反义核酸是指能与特定 mRNA 精确互补、特异阻断其翻译的 RNA或 DNA 分子利用反义核酸特异地封闭某些基因表达，使之低表达或不表达，这种技术即为反义核酸技术[1-3]它包括反义RNA、反义 DNA 和核酶(ribozymes)三大技术反义核酶作为一种基因下向调节作用因子，在抑制一些有害基因的表达和失控基因的过度表达上发挥着重要作用随着反义核酶技术的发展和成熟，已逐渐应用于抗某些人体寄生虫病的研究本文拟就反义核酸技术的作用原理和特点作一简要概述，着重阐述其在寄生虫领域中的应用进展1　反义核酸的作用原理反义核酸目前有三种来源：一是利用固相亚磷酰胺法人工合成的短小反义寡聚核苷酸(antisense oligodeoxyncleotides，AON)，这是反义核酸最普遍的应用方式，包括未修饰 AON 和硫代磷酸酯化(PS)、磷酸二酯化(PO)和甲基化等修饰 AON 二类，其中以PSAON 应用最广泛ANO 设计合成简单，只要其顺序与靶mRNA 部分顺序互补即可，而对基因的读码框无要求；二是更具有实用价值的工人表达载体，包括单个基因和多个基因的联合反义表达载体[3]，它是利用基因重组技术将靶基因序列反向持插入到载体的启动子和终止子之间，通过转录可源源不断产生反义 RNA 分子；2三是天然存在的反义核酸分子，但目前分离纯化尚存在困难。

1.1　 反义 RNA 和反义 DNA反义 RNA 是指能和 mRNA 完全互补的一段小分子 RNA 或寡聚核苷酸片段，反义 DNA 是指能与基因 DNA 双链中的有义链互补结合的短小 DNA 分子反义 RNA 和反义 DNA 主要是通过mRNA 的翻译和基因 DNA 的转录而发挥作用[10] ：1)抑制翻译反义核酸一方面通过与靶 mRNA 结合形成空间位阻效应，阻止核糖体与 mRNA 结合，另一方面其与 mRNA 结合后激活内源性 RNase或 ribozyme，降解 mRNA[3]；2)抑制转录反义 DNA 与基因DNA 双螺旋的调控区特异结合形成 DNA 三聚体(triplex),或与DNA 编码区结合，终止正在转录的 mRNA 链延长[3]此外，反义核酸还可抑制转录后 mRNA 的加工修饰，如 5’端加帽、3’端加尾(poly a)、中间剪接和内部碱基甲基化等，并阻止成熟 mRNA 由细胞核向细胞浆内运输1.2　 核酶Cech 等发现四膜虫核糖体 RNA 前体在成熟过程中，可精确地自我切除某些片段并重新连接，这种具有酶催化活性的 RNA 称之为核酶[11,12]3核酶广泛存在于生物细胞中，有锤头状和发夹二种结构。

酶活性中心由两个臂和中间的功能区组成[13]两个臂序列高度保守，与靶 RNA 特异互补结合，相当于一种反义 RNA，而功能区则可通过降解 RNA 的磷酸二酯键而分解消化靶 RNA，而核酶本身在作用过程中并不消耗核酶裂解分子依赖严格的空间结构形成，裂解部位总是位于靶 RNA 分子中 GUX 三联体(X：C 、U、A)下游方向即3’端[12]核酶除天然存在外，也可人工合成根据核酶的作用位点、靶 mRNA 周围的序列和核酶本身高度保守序列，可方便地人工设计合成核酶的特异性序列此外，利用基因工程将核酶的编码基因克隆在 SP6 或 T7 等启动子下游，通过转录合所需核酶核酶能特异切割 RNAA 分子，使阻断基因表达，特别是阻断有害基因的表达成为可能如果已知靶 mRNA 中 GUX 三联体的位置，可将核酶的编码基因插入反义表达载体的适当位置，这样转录所产生的含有核酶的反义 RNA 具有双重功能：一方面具有反义抑制作用，另一方面具有切割靶 mRNA 的催化作用核酶在抗肿瘤、抗病毒方面具有十分诱人的前景，第一个应用核酶进行艾滋病基因治疗的临床计划已获准，核酶作为一种遗传信息药物，在肿瘤基因治疗中必将日益受到重视。

42　反义核酸的作用特点反义核酸作为基因治疗药物之一，与传统药物相比具有诸多优点1)高度特异性：反义核酸药物通过特异的碱基互补配对作用于靶 RNA 或 DNA，犹如“生物导弹” 2)高生物活性、丰富的信息量；反义核酸是一种携带特定遗传信息的信息体，碱基排列顺序可千变万化，不可穷尽3)高效性：直接阻止疾病基因的转录和翻译4)最优化的药物设计：反义核酸技术从本质上是应用基因的天然顺序信息，实际上是最合理的药物设计5)低毒、安全：反义核酸尚未发现其有显著毒性，尽管其在生物体内的存留时间有长有短，但最终都将被降解消除，这避免了如转基因疗法中外源基因整合到宿主染色体上的危险性3　反义核酸技术在寄生虫学中的应用反义核酸技术的飞速发展和成熟，使其逐渐渗透并应用到寄生虫学领域，丰富和发展了寄生虫病的基因治疗策略反义核酸技术在抗寄生虫病研究的应用主要集中于原虫类，如疟原虫、锥虫和利什曼原虫等，而且反义核酸中又以 AON 方面的报道最多下面着重就 AON 在寄生虫方面的研究应用作用一简要阐述3.1　 疟原虫 5疟原虫嘌呤核苷酸合成具有特殊性，即无从头合成途径，依靠补救合成途径利用体内游离的嘌呤或嘌呤核苷疟原虫的二氢叶酸还原酶(dihydrofolate reductase，DHFR)和胸苷酸合酶(thymidylate synthase，TS) 结合形成双功能蛋白 (DHFR-TS)，这对于维持疟原虫四氢叶酸水平和 DNA 合成极为重要[14]，此酶也是疟原虫脱氧胸苷酸生物合成唯一通路中必不可少的酶。

抗疟药中的抗叶酸代谢药如乙胺嘧啶，就是通过竞争性抑制 DHFR-TS 来阻断虫体脱氧胸苷酸生物合成[15]然而，随着恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)多药抗性株的出现和广为传播，疟疾的化疗面临重大挑战，促使人们寻求新的抗疟疗法目前，DHFR-TS是 AON 抗疟作用首选靶基因生物大分子进入感染红细胞中的疟原虫，必需穿透三层膜，即红细胞膜、纳虫泡膜和虫体的胞质膜研究表明，不能穿透红细胞膜和纳虫泡膜的大分子和葡聚糖、IgG2a 抗体和蛋白 A 等，可经过纳虫微管(parasitophorous duct)进入虫体，虫体通过胞吞作用直接从细胞外摄入大分子物质[16]因此，对于小分子的 AON 而言，作用于感染红细胞中的虫体完全成为可能，下述众多研究已充分证明了这一点Rapaport 等(1992) 研究发现 [17]，以 DHFR-TS为靶 21 nt PS AON 能选择性地进入恶性疟原虫感染红细胞，对体外培养的氯喹敏感株和耐药株虫体具有同等的抑制效果，而未感染6疟原虫的红细胞则完全为不摄入 AON，因此这对应用反义核酸于抗疟治疗非常有利诸多研究表明，AON 越长，对转译的抑制作用就越强；AON 浓度越高，非特异性抑制作用越明显，在低浓度时则呈特异性抑制。

Sartorius 和 Franklin(1991)以 DHFR-TS 的 mRNA 为靶合成系列 AON，利用兔网织红细胞翻译系统，探讨 AON 对体外转译的抑制作用[18] 在 DHFR 翻译起始位点处合成了 6 条 21－49nt不等长的 AON，在 TS 编码区全成的 30nt、39nt 和 49nt 三条AON当 AON 长度为 30nt 或更长时，呈明显转译抑制作用，抑制率可高达 50％以上其中，TS 编码区的 49nt aON(OTS49)抑制效果最高，当浓度在 45μmlo/L 时的抑制率几乎达 90％，主要是因为 OTS49 与 DHFR-TS 靶 mRNA 结合抑制 TS 合成，这从翻译产物的分子量(55 kDa)要比天然 DHFR-TS(71 kDa)小且无 TS 活性可看出Ramasamy 等和 Clark 等研究表明，在较高浓度下，无论DHFR-TS 正义还是反义的寡聚核苷酸(M1K，M2K)，均能抑制裂殖子入侵红细胞[19,20]究其原因，可能与高浓度的 AON 带有较多的负电荷有关Kanagaratnam 等(1998) 分析了疟原虫裂殖子表面蛋白基因的反义和正义寡聚核苷酸对疟原虫体外生长的影响[21]，无论 AON 单独使用抑或与脂质体混合使用，均未观察到特异抑制7效应。

但在相同浓度范围内，反义和正义寡核苷酸以及具有多聚阴离子的硫酸葡聚糖，均可抑制裂殖子入侵红细胞当寡聚核苷与阳离子脂质体结合后负电荷被中和时，则对裂殖子入侵红细胞的抑制作用被取消由此推测，寡聚核苷酸有可能借助其多聚阴离子特性干扰裂殖子与细胞上受体结合，多聚阴离子可能对疟疾病治疗有帮助3.1.2　AON 不同修饰物对抗疟作用影响最近，Barker 等以 DHFR-TS 基因为靶，比较了硫代磷酸酯化(PS)、磷酸二酯化(PO)和甲基化修饰 AON，以及不同空间结构AON 对体外培养虫体生长抑制作用[22]结果显示，5’和 3’端至少含有 3 个 PS 基因的 PO-PS 杂合体 AON、全部为 PS 修饰的AON，与部分 PS 修饰的 AON 抑制作用相同在低浓度下(1μmol/L)，PO-PS aON 和 PS AON 比 PS-甲基化 AON 抑制率高25％此外，通过延长 AON 序列增加干-环结构形成，提高 AON的自我稳定性，结果获得 2 个有干- 环结构的 AON(RB39、RB41)，其抑虫生长率比序列未延长的 AON 约要高 20％3.1.3　AON 不同靶基因对抗疟作用影响AON 对不同基因的抑制作用不一致，这和该基因在虫体代谢8过程中是否起举足轻重作用密切相关[14]。

AON 的抗疟研究主要集中在 DHFR-TS 基因，这固然与其在疟原虫核苷酸代谢中的特殊地位有关(见前述 )Barker 等(1996) 对恶性疟原虫耐药株多个靶基因的 AON 作用进行了比较研究[23]，方法是将 PS aON 加入到疟原虫体外培养液中，培养 48 小时后，通过镜检和 3 氚-次黄嘌呤掺入试验观察 AON 对虫体的生长抑制作用结果表明，抑制作用与AON 浓度密切相关当 AON 浓度为 1μmol/L 时，AON 呈非特异性抑制；当浓度在 0.5－0.005μmol/L 范围时，以 DHFR-TS、二氢喋呤合成酶、核苷酸还原酶、裂殖体多基因家族和红细胞结合抗原-175 为靶的 PS aON 与对照组相比，均能特异地显著抑制虫体生长(P＜ 0.0001)，而 DNA 聚合酶 α 的 PS aON 抑制作用更弱，磷酸丙糖异构酶的 PS AON 抑制作用则与对照组相同疟原虫感染红细胞中，近 75％血红蛋白被滋养体降解而形成大量对虫体有害的血红素，必须在消化泡中聚集成对虫体无毒的疟色素[24,25]研究表明，恶性疟原虫组氨酸富集蛋白(HRP) 家族中，HRPⅡ和 HRPⅢ有明显的促进疟色素形成功能[26]。

因此，如能特异阻断这些基因表达，抑制疟色素的形成，有可能使之成为一种抗疟新途径HRPⅡ 与 HRPⅢ 从同一祖先基因分化而来，二者高度同源，翻译起始位点附核苷酸序列则完全相同[27,28]3.2　 锥虫9属于动基体目的布氏锥虫(Trypanosoma burcei)通过抗原不断变异逃避宿主的免疫力，抗原变异是由于不同的变异体专一表面糖蛋白(variant-specific surface glycoprotein，VSG) 基因呈间断表达所致，VSG 基因表达产物在锥虫表面形成外膜，覆盖虫体[29,30]研究表明，VSG mRNA 可分为二部分[31,32] ：一部分是各种变异体特有的主外显子序列，占主要部分；另一部分是共同的5’端小外显子序列，通常为 35 个核苷酸长，几乎所有的 VSG mRNA 均含有此序列实际上，除 VSG 外，锥虫的钙调蛋白、微管蛋白和磷酸丙糖异构酶 mRNA 中也存在共同的 5’端小外显子序列，这似乎是动基体目寄生原虫编码基因的共同结构特征[32]由于宿主 mRNA 无这种小外显子序。