分子与基因工程实验七(2011).ppt

实验七 农杆菌介导的叶盘法转化目的及要求：通过叶盘法将带有报告基因的农杆菌转 入烟草中，诱导获得转基因植株了解农杆菌转化植物的原理，掌握农杆 菌的培养和侵染植物的方法二、实验原理农杆菌重组子中携带经改造的Ti 质粒（含有帮助T- DNA跳到植物染色体上的Vir 区）和包含T-DNA的双元 载体pBinGUS，质粒pBinGUS上T-DNA上插入了报告 基因（GUS）和卡那霉素筛选标记基因NPTII叶盘法转化是通过人为在烟草叶片上产生伤口，侵染 时农杆菌吸附于植物的表面伤口部位，受伤后双子叶植 物分泌的酚类化合物透过农杆菌的细胞膜，活化vir区 基因，vir区基因的活化，促使T-DNA进行加工和转移 T-DNA进入植物细胞后整合到核DNA上共培养可 使T-DNA上携带的编码抗生素的抗性基因得到表达， 因此，转化了的烟草外植体可在含有相应抗生素的培养 基上生长植物基因转化受体系统指用于转化的外植体通过组织培养途径或其他非组织培养 途径，能高效、稳定地再生无性系，并能接受外源DNA 整合，对转化选择抗生素敏感的再生系统具备条件： （1）高效稳定的再生能力 （2）较高的遗传稳定性 （3）具有稳定的外植体来源 （4）对选择性抗生素敏感 （5）对农杆菌侵染有敏感性外植体的种类叶片、叶柄、子叶、子叶柄茎、花茎、块茎、茎尖分生组织根合子胚成熟种子叶盘法转化双子叶植物以叶片作为外植体，在叶片上产生伤口，侵染 时农杆菌吸附于植物的表面伤口部位;受伤后双子叶植物分泌的酚类化合物透过农杆 菌的细胞膜，活化vir区基因，vir区基因的活化 ，促使T-DNA进行加工和转移。

T-DNA进入植 物细胞后整合到核DNA上 农杆菌与外植体共培养接种菌体后的外植体培养在诱导愈伤组织的固 体培养基上，在外植体细胞分裂、生长的同时 ，农杆菌在外植体切口面也增殖生长，该两者 共同培养过程称之为共培养是整个转化过程中非常重要的环节因为农杆 菌吸附，T-DNA的转移及整合都在这共培养时 期内完成Events An 'event' is the insertion of a particular transgene into a specific location on a chromosome.ConceptionsTransformation frequencyIndependent transgenic plants/inoculated immature embryo or callus.Line The seedlings from one transgenic cell, namely, one independent successfully transformation event, belong to one line, also are called clones. GenerationThese transgenic seedlings are T0 generation seedlings, T0 generation mature seeds are T1 generation…Meiosis or pollination is the boundary of different generations. 实验仪器、材料和试剂仪器：超净工作台，培养箱，台式离心机，培养皿，加样器及吸头，无菌滤纸； 材料：携带质粒植物表达(pBI121)载体土壤农杆菌LBA4404 烟草无菌苗 试剂：YEB液体培养基（1升）：酵母提取物1g，牛肉膏5g，蛋白胨5g，蔗糖5g，MgSO4.7H2O 0.5g, pH7.0MS盐：MS大量元素、微量元素、pH7.0；MS基本培养基：MS大量元素、微量元素、有机物，3%蔗糖，0.8 %琼脂，pH5.8；实验步骤1. 从平板上挑取含有pBI121的农杆菌LBA4404单 菌落，接种于50ml YEB液体培养液(含有 100mg/L Kan和125mg/L Sm)中，28°C振荡培 养至OD600为0.6-0.8；2. 4000rpm，室温离心10分钟，倒掉上清.3. 用MS盐溶液（pH7.0）重新悬浮菌体，侵染时 采用MS盐溶液稀释至原体积的20-50倍。

4. 在超净台上从烟草无菌苗上切下叶片,切去边缘 和主要叶脉，切成0.4×0.6cm2大小；5. 侵染：将切好的外植体在农杆菌菌液中浸泡10分钟 ，取出外植体置于无菌滤纸上吸去材料表面的菌液 6. 共培养，将侵染过的外植体接种在上铺一层滤纸的 MS基本培养基，28°C暗培养三天7.外植体暗培养三天后，转到含有抗生素的分化培养 基（MS+3mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+ Kan 100mg/L + Cb 500mg/L）上，在光照为2000- 10000lx，25°C条件下进行选择培养8. 三天观察一次，发现污染，立刻转入新的相同培养 基中注意事项1．烟草无菌苗上切下叶片后，注意迅速盖好封口 膜2．严格控制叶盘在农杆菌菌液中的浸泡时间3．避免外植体于无菌滤纸上过于干燥思考题1．培养农杆菌LBA4404时加Sm的作用是什么？2．暗培养时培养基中是否要加抗生素？为什么？。