常用限制性内切酶酶切位点保护残基.docx

酶切位点保护碱基-PCR引物设计用于限制性内切酶发布：2010-05-24 20:19 |来源:生物吧|编辑:刘浩|查看：161次本文给出了分 子克隆中常用限制 性内切酶的保护碱基 序列，如 AccI，AflIII ，AscI ，AvaI ， BamHI ，BglII ，BssHII ，BstEII ，BstXI ，ClaI ，EcoRI ，HaeIII ，HindIII ， KpnI，MluI，NcoI，NdeI，NheI，NotI，NsiI，PacI，PmeI，PstI， PvuI ， SacI ， SacII ， SalI ， ScaI ， SmaI ， SpeI， SphI ， StuI， XbaI ， XhoI ，XmaI ，为什么 要添加保护碱基 ？在分子克隆实 验中，有时我们会在待扩增的 目的基因片段两端加上特定的酶切位点， 用于后续的酶切和连接反应由 于直接暴露在末端的酶切位点不容易直接 被限制性核酸内切酶切开，因此在设 计 PCR 引物时，人为的 在酶切位点序 列的 5‘端 外侧添加额外的碱基序列，即 保护碱基，用来提高 将来酶切时的 活性其次，在分子克隆实验中选择载体 的酶切位点时， 相临的两个酶切位点 往往不能同时 使用，因为一个位点切割后留下 的碱基过少以至于影响旁边 的酶切位点切 割。

该如何 添加保护碱基？添加保护碱基 时，最关心的应该 是保护碱基的数 目，而不是种类什么样的酶切位点 ，添加几个保护碱基，是有数据 可以参考的添加什么保护 碱基，如果严格点，是根据两条引物 的 Tm 值和各引物的碱基分布及GC含量如果某条引物Tm值偏小，GC%较低，添加时多加 G或C,反之亦反为了解不同内 切酶对识别位点以外最少保护碱 基数目的要求， NEB 采 用了一系列含 识别序列的短双链寡核苷酸作为 酶切底物进行实验实验结 果对于确定双 酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位 点很接近时）， 或者当切割位 点靠近 DNA 末端时也很 有用在本表中没有列出 的酶，则通 常需在识别位 点两端至少加上 6 个保护 碱基，以确保酶切反应的进行实验方法：用Y-[32P]ATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标 记0.1A260单位的寡核苷酸取1pg已标记了的寡核苷酸与20单位的内切酶，在2 0°C 条件下分别反 应 2 小时和 20 小时反应缓冲液 含 70mM Tris-HCl（pH 7.6）, 10 mM MgC— , 5 mMDTT 及适量的 NaCI 或 KCl （视酶的具体要求而定 ）。

20%的 PAGE（7M 尿素）凝胶电泳分析 ，经放射自显影确定酶切百分 率本实验采用自 连接的寡核苷酸作为对照 若底物有较长的回文结 构，切 割效率则可能 因为出现发夹结构而降低酶寡核苷酸序列切割率％2 hr20 hrAcc IGGTCGACC00CGGTCGACCG00CCGGTCGACCGG00Afl IIICACATGTG00CCACATGTGG>90>90CCCACATGTGGG>90>90Asc IGGCGCGCC>90>90AGGCGCGCCT>90>90TTGGCGCGCCAA>90>90Ava ICCCCGGGG50>90cccccggggg>90>90TCCCCCGGGGGA>90>90BamH ICGGATCCG1025CGGGATCCCG>90>90CGCGGATCCGCG>90>90Bgl IICAGATCTG00GAAGATCTTC75>90GGAAGATCTTCC25>90BssH IIGGCGCGCC00AGGCGCGCCT00TTGGCGCGCCAA50>90BstE IIGGGT(A/T)ACCC010BstX IAACTGCAGAACCAATGCATTGG00AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA2550CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT25>90Cla ICATCGATG00GATCGATC00CCATCGATGG>90>90CCCATCGATGGG5050EcoR IGGAATTCC>90>90CGGAATTCCG>90>90CCGGAATTCCGG>90>90Hae IIIGGGGCCCC>90>90AGCGGCCGCT>90>90TTGCGGCCGCAA>90>90Hind IIICAAGCTTG00CCAAGCTTGG00CCCAAGCTTGGG1075Kpn IGGGTACCC00GGGGTACCCC>90>90CGGGGTACCCCG>90>90Mlu IGACGCGTC00CGACGCGTCG2550Nco ICCCATGGG00CATGCCATGGCATG5075Nde ICCATATGG00CCCATATGGG00CGCCATATGGC G00GGGTTTCATATGAAACCC00GGAATTCCATATGGAATTCC75>90GGGAATTCCATATGGAATTCCC75>90Nhe IGGCTAGCC00CGGCTAGCCG1025CTAGCTAGCTAG1050Not ITTGCGGCCGCAA00ATTTGCGGCCGC TTTA1010AAATATGC GGCCGC TATAAA1010ATAAGAATGCGGCCGC TAAACTAT2590AAGGAAAAAAGC GGCCGCAAAAGGAAAA25>90Nsi ITGCATGCATGCA10>90CCAATGCATTGGTTC TGCAGTT>90>90Pac ITTAATTAA00GTTAATTAAC025CCTTAATTAAGG0>90Pme IGTTTAAAC00GGTTTAAACC025GGGTTTAAACCC050AGCTTTGTTTAAAC GGCGCGCCGG75>90Pst IGCTGCAGC00TGCACTGCAGTGCA1010AACTGCAGAACCAATGCATTGG>90>90AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA>90>90CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT00Pvu ICCGATCGG00ATCGATCGATTCGCGATCGCGA1002510Sac ICGAGCTCG1010Sac IIGCCGCGGC00tccccgcgggga50>90Sal IGTCGACGTCAAAAGGCCATAGCGGCCGC00GCGTCGACGTCTTGGCCATAGC GGCCGCGG1050ACGCGTC GACGTCGGCCATAGCGGCCGC GGAA1075Sca IGAGTACTC1025AAAAGTACTTTT7575Sma ICCCGGG010CCCCGGGG010CCCCCGGGGG1050TCCCCCGGGGGA>90>90Spe IGACTAGTC10>90GGACTAGTCC10>90CGGACTAGTCCG050CTAGAC TAGTC TAG050Sph IGGCATGCC00CATGCATGCATGACATGCATGCATGT1002550Stu IAAGGCCTT>90>90GAAGGCCTTC>90>90AAAAGGCCTTTT>90>90Xba ICTCTAGAG00GCTCTAGAGC>90>90TGCTCTAGAGCA75>90CTAGTC TAGACTAG75>90Xho ICCTCGAGG00CCCTCGAGGG1025CCGCTCGAGCGG1075Xma ICCCCGGGG00CCCCCGGGGG2575CCCCCCGGGGGG50>90TCCCCCCGGGGGGA>90>90注释：1．如果要加在序列的 5‘端，就在酶切位点识别碱基序列（红色）的5'端加上相应的碱基（黑色），相同如果要在 3‘端加保护碱基，就在酶切位点识别碱基序列（红色）的 3'端加上相应的碱基（黑色）。

2．切割率：正确识别并酶切的效率3加保护碱基时最好选用切割率高时加的相应碱基。