血凝血凝抑制试验总结.doc

1、 如果是马上要做实验，先把实验所需的抗原、标准阳性血清、阴性血清、待检血清取 出回温，如果待检血清已冷藏，可取出放入 37℃恒温培养箱中回温，待血清析出后取 出（时间大约看具体情况而定） 2、 试验准备阶段： a 准备好清洗干净的血清离心管（要有刻度装血液） b 采血：注射器内先加入一半体积的阿氏液（防止血液凝集，当所需红细胞较多时，加入 注射器量程一半的阿氏液，当所需红细胞较少时，加入 1.5 ml～2 ml 的阿氏液） c 1%红细胞悬液的制备 采集至少 3 只 SPF（无特定病原体）公鸡或无禽流感和新城疫等抗体的健康公鸡的血液与 等体积的阿氏液混合，用 PH 7.2、0.01 mol/L PBS 液洗涤 3 次，每次去掉上层的清液后加 入少量 PBS 用注射器反复抽吸使之混匀，再加至所要刻度，放入离心每次均以 1000 r/min 离心 10 min，洗涤后用 PBS 配成体积分数为 1%的红细胞悬液，4℃保存备用（实际 PBS 液用 1%的生理盐水代替） d 所需 1%红细胞悬液的体积 ≥ 4 HAU+1 ml（本例中为 30 ml+1 ml=31 ml） ，否则配置的 1%红 细胞悬液不够用（理论计算为 30.1 ml，取 31 ml 以防万一） 。

e 阿氏液（Alsevers）制备 葡萄糖 2.05 g 柠檬酸钠 0.80 g 柠檬酸 0.055g 氯化钠 0.42 g 加蒸馏水至 100 ml，散热溶解后调 PH 值至 6.1, 69 kPa 高压灭菌 15 min，4℃保存备用 3、 血凝试验 目的：检测试验所用的标准抗原的血凝滴度，如检测结果血凝滴度为 210 = 1024，表示标准 抗原稀释 1024 倍仍能与红细胞发生凝集反应 注意： 一瓶新的未使用的抗原（禽流感或新城疫为粉状） ，需要加入（用注射器）2ml 的稀释液 （0.9%生理盐水，一般瓶身上有标注加入的体积 2ml） a 反应板要同时做三排（每排 12 孔） ，原因：根据三排的多数结果来确定血凝滴度例如： 三个结果为：210、29、29，则本次试验标准抗原血凝滴度为 29 b 加入 1%的红细胞悬液后放到微量震荡器上震荡混合 1min，室温 20℃～25℃下静置 40 min，放 4℃静置 60 min当 PBS 对照孔红细胞呈明显纽扣状沉到孔底时判定结果 4、 4 HAU 抗原 例如：标准抗原血凝滴度为 210 = 1024，则 4 HAU 抗原=（1：210）/4 = 1：256，稀释时， 将 1 ml 的抗原加入到 255 ml 的 PBS 中即为 4 HAU。

5、 计算配置 4 HAU 所需稀释液体积 V 和标准抗原体积 X 假设：待检血清 100 份 每排 12 个孔（实际只需要 11 孔，但多计算一些，以防不够） 每孔加入 25 ul 4 HAU 抗原体积 = 25 ul×12×100 = 30000 ul = 30 ml 设标准抗原体积为 X 则有： 1 ：256 = X ：30000 标准抗原体积 X = 3000 / 256 = 117.1875 ul =0.117 ml 稀 释 液体积 V = 30 - 0.117 = 29.883 ml 但实际量取时稀释液体积直接用 30ml 计算，因为 0.117 ml 数量很小，可以忽略不计 6、 血凝抑制试验 a 红细胞在使用过程中应经常摇匀b 加入 1%的红细胞悬液后放到微量震荡器上震荡混合 1min，室温 20℃～25℃下静置 40 min，若环境温度过高，放 4℃静置 60 min当 PBS 对照孔红细胞呈明显纽扣状沉到孔底 时判定结果 7、 结果判定 血凝试验：将反应板倾斜，看是否呈泪滴状，不呈泪滴状的说明发生血凝 血凝抑制：将反应板倾斜，看是否呈泪滴状，呈泪滴状的说明未发生血凝或血凝不完全即 血凝抑制8、。