ncbi primer-blast使用方法.doc

Primer-BLAST是 NCBI的引物设计和特异性检验工具Primer-Blast介绍Primer-BLAST，设计用于聚合酶链反应（PCR）的特异性寡核苷酸引物Primer-BLAST可以直接从 Blast主页（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）找到，或是直接用下面的链接进入：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/这个工具整合了目前流行的 Primer3软件，再加上 NCBI的 Blast 进行引物特异性的验证Primer-BLAST 免除了用另一个站点或工具设计引物的步骤，设计好的引物程序直接用 Blast进行引物特异性验 证并且，Primer-BLAST 能设计出只扩增某一特定剪接变异体基因的引物–an important feature for PCR protocols measuring tissue specific expression（注：没办法准确的翻译，只好作罢，汗！）Primer-BLAST 有许多改进的功能，这样在选择引物方面比单个的用 Primer3 和 NCBI BLAST更加准确。

Primer-BLAST的输入Primer-BLAST界面包括了 Primer3和 BLAST的功能提交的界面主要包括三个部分：target template（模板区）, the primers（引物区）, 和specificity check（特异性验证区）跟其它的 BLAST一样，点击底部的“Advanced parameters”有更多的参数设置模板（Template）在“PCR Template”下面的文本框，输入目标模板的序列，FASTA 格式或直接用 Accession Number如果你在这里输入了序列，是用于引物的设计Primer-BLAST就会根据你输入的序列设计特异性引物，并且在目标数据库（在specificity check区选择）是唯一的引物（Primers）如果你已经设计好了引物，要拿来验证引物的好坏可以在 Primer Parameters区填入你的一条或一对引物并且选择好验证的目标数据库（在specificity check区选择）根据需要可设置产物的大小，Tm 值等特异性（Specificity）在 specificity check区，选择设计引物或验证引物时的目标数据库和物种。

这一步是比较重要的这里提供了 4种数据库：RefSeq mRNA, Genome (selected reference assemblies), Genome (all chromosomes), and nr (the standard non-redundant database)前两个数据库是经过专家注释的数据，这样可以给出更准确的结果特别是，当你用 NCBI的参考序列作为模板和参考序列数据库作为标准 来设计引物时，Primer-BLAST 可以设计出只扩增某一特定剪接变异体基因的特异引物selected reference assemblies 包括以下的物种： human, chimpanzee, mouse, rat, cow, dog, chicken, zebrafish, fruit fly, honeybee, Arabidopsis, 和 riceNr 数据库覆盖NCBI所有的物种实例分析用人尿嘧啶 DNA糖基化酶(uracil-DNA glycosylase genes, UNG, GeneID: 7374)的两个转录本序列作为一个例子来分析UNG1 的序列长一点（NM_003362），UNG2 的序列短一点（NM_080911，注：拿这两个基因的序列ClustalW一 下就可以了）。

这里用 UNG2的序列设计引物，选择 RefSeq mRNA database，物种是 Human，其它默认结果如下图 A-B所示，设计的引物只能扩增出 UNG2看上面的图，把“Allow primer to amplify mRNA splice variants”这个选项给勾上，出现的结果如下图-C 所示，新的引物也可以扩增出 UNG1（注：我试了一下，不能得到预期的结果，可能参数没设对）Figure. Primer-BLAST results for UNG transcript variant 2. The NCBI Reference sequence NM_080911 was used as a template. Top panel: Primers specific to the single splice variant are reported by default with the mRNA RefSeq database limited to human sequences. Bottom panel: Primers that amplify both splice variants are found with the option to allow splice variants.(点击看大图)一些 Tips1，在任何时候都要优先使用参考序列的 Gi号或 Accession 号（尽量不要Fasta格式的序列）。

另外，确保你的序列是最新版本的（在填 Accession Number时后面不加版本号就会自动拿最新的序列）2，就算你对整个序列的某部分感兴趣（如某条染色体上的某个区域），你也应该优化使用 Gi号或 Accession 号（Primer-BLAST 有参数可以设置设计引物的范围，”Form-To”，如上面的第一幅图所示）因为用 Gi号或 Accession 号，NCBI会自动读取该序列的一些注释数据，对引物的设计更加有利3，尽量使用没有冗除的数据库（如 refseq_rna 或 genome database），nr 数据库包括了太多的冗除的序列，会干扰引物的设计4，请指定一个或几个 PCR扩增的目标物种如果不指定在所有的物种搜索，将会使程序变得很慢，引物的结果也会受其它不相关的物种影响参考文献1. Steve Rozen and Helen J. Skaletsky (2000) Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. In: Krawetz S, Misener S (eds) Bioinformatics Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology. Humana Press, Totowa, NJ, pp 365-386.来源于 Primer-BLAST：NCBI 的引物设计和特异性检验工具 | 柳城博客。