PCR常见问题分析及对策(无扩增产物非特异性扩增拖尾假阳性).doc

PCR常见问题分析及对策（无扩增产物、非特异性扩增、拖尾、假阳性）2009-03-28 11:38现象：正对照有条带，而样品则无M 样品样品正对照问题1:无扩增产物 原因：1•模板:含有抑制物，含量低2. Buffer对样品不合适3 •引物设计不当或者发生降解4. 反应条件：退火温度太高，延伸时间太短 对策：1. 纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模 板的用量2. 更换Buffer或调整浓度3. 重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构） 或者换一管新引物4. 降低退火温度、延长延伸时间问题2：非特异性扩增 现象：条带与预计的大小不一致或者M 1 2 3非特异性扩增带原因：1・引物特异性差2 .模板或引物浓度过高3 .酶量过多4. Mg2+浓度偏高5. 退火温度偏低6 .循环次数过多对策：1 •重新设计引物或者使用巢式PCR2. 适当降低模板或引物浓度3. 适当减少酶量4 •降低镁离子浓度5 •适当提高退火温度或使用二阶段温度法6. 减少循环次数问题3：拖尾现象：产物在凝胶上呈Smear状态原因：1 •模板不纯2. Buffer不合适3. 退火温度偏低4. 酶量过多5. dNTP、Mg 2+浓度偏高6 •循环次数过多对策：1 •纯化模板2. 更换 Buffer3. 适当提高退火温度4. 适量用酶5. 适当降低dNTP和镁离子的浓度6. 减少循环次数问题4：假阳性现象：空白对照出现冃的扩增产物原因：靶序列或扩增产物的交*污染对策：1. 操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；2. 除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。

所用离心管 及加样枪头等均应一次性使用3. 各利试剂最好先进行分装，然后低温贮存PCR引物设计的黄金法则(转自tiangen)1•引物最好在模板cDNA的保守区内设计DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的在NCBI上搜索不同 物种的同一基因,通过序列分析软件(比如DNAman)比对(Alignment)，各 基因相同的序列就是该基因的保守区2.引物长度一般在15〜30碱基之间引物长度(primer length)常用的是18-27 bp,但不应大于38,因为过长会导致 其延伸温度大于74°C,不适T Taq DNA聚合酶进行反应3•引物GC含量在40%〜60%Z间，Tm值最好接近72°CGC含量(composition)过高或过低都不利丁引发反应上下游引物的GC含量 不能相差太大另外，上下游引物的Tm值(melting temperature)是寡核甘酸的 解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核昔酸双链解链的温度有效启动温 度，一般高于Tm值5〜10°C若按公式Tm二4 (G+C) +2 (A+T)估计引物的 Tm值，则有效引物的Tm为55〜8()°C,其Tm值最好接近72°C以使复性条件最 佳。

4. 引物3,端要避开密码子的第3位如扩增编码区域，引物3,端不耍终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发 生简并，会影响扩增的特异性与效率5•引物3,端不能选择A,最好选择T引物3端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时, 即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T吋，错配的引发 效率大大降低，G、C错配的引发效率介TA、TZ间，所以3,端最好选择T6. 碱基耍随机分布引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3,端相似性较高的序列，否则容 易导致错谋引发(False priming)降低引物与模板相似性的一种方法是，弓I物 中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嚓吟或聚卩密喘的存在尤其丁端不应 超过3个连续的G或C,因这样会使引物在GC富集序列区错误引发7. 引物口身及引物Z间不应存在互补序列引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构(Hairpin)使弓I物 本身复性这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合引物自身 不能有连续4个碱基的互补两引物Z间也不应具有互补性，尤其应避免3,端的互补重叠以防止引物二聚体 (Dimer与Cross dimer)的形成。

引物之间不能有连续4个碱基的互补引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使具AG值不要过高(应小于 4.5kcal/mol) o否则易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行8. 引物亍端和中间AG值应该相对较高，而丁端AG值较低△G值是指DNA双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对 稳定性，AG值越大，则双链越稳定应当选用亍端和中间AG值相对较高， 而3,端AG值较低(绝对值不超过9)的引物引物3,端的AG值过高，容易 在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应不同位置的AG值可以用 Oligo 6软件进彳亍分析)9. 引物的亍端可以修饰，而3,端不可修饰引物的亍端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大因此，可以被 修饰而不影响扩增的特异性引物5,端修饰包括：加幽切位点；标记生物索、 荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入点突变、插入突变、 缺失突变序列；引入启动子序列等引物的延仲是从3,端开始的，不能进行任何修饰3,端也不能有形成任何二级 结构可能10. 扩增产物的单链不能形成二级结构某些引物无效的主要原因是扩増产物单链二级结构的影响，选择扩增片段时最好 避开二级结构区域。

用有关软件（比如RNAstructure）可以预测估计mRNA的 稳定二级结构，有助于选择模板实验表明，待扩区域自由能（AG小于58.61 kJ/mol时，扩增往往不能成功若不能避开这一区域时，用7-deaza-2r-脱氧GTP 取代dGTP对扩增的成功是有帮助的11. 引物应具有特异性引物设计完成以后，应对具进行BLAST检测如果与其它基因不具有互补性， 就可以进行下一步的实验了值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一有的模板木身条件比较困难，例 如GC含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；用作克隆冃的 的PCR,因为产物序列相对固定，引物设计的选择自由度较低在这种情况只 能退而求其次，尽量去满足条件做Real Time时，用丁 SYBR Green I法时的一对引物与一般PCR的引物，在引物设 计上所耍求的参数是不同的引物设计的要求：1） 避免重复碱基，尤其是G.2） Tm=58-60 度3） GC=30-80%.4） 3,端最后5个碱基内不能有多于2个的G或C.5） 正向引物与探针离得越近越好，但不能重叠6） PCR扩增产物长度：引物的产物大小不要太大，一般在80-250bp Z间都可； 80〜150 bp最为合适（可以延长至300 bp） o7） 引物的退火温度要高，一般要在60度以上；要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在。

而且引物设计时应该考虑到引物耍有不受基因组DNA污染影响的能力，即引物 应该跨外显子，最好是引物能跨外显子的接头区，这样可以更有效的不受基因组 DNA污染的影响至于设计软件，PRIMER3,PRIMER5,PRIMER EXPRESS都应该可以的做染料法最关键的就是寻找到合适的引物和做污染的预防工作对丁•引物，你要 有从一大堆引物中挑出一两个能用的引物的思想准备一寻找合适的引物非常不 容易关于BLAST的作用应该是通过比对，发现你所设计的这个引物，在已经发现并 在GENEBANK中公开的不物种基因序列当中，除了和你的冃标基因Z外，还有 没有和其他物种或其他序列当中存在相同的序列，如和你的冃标序列Z外的序列 相同的序列，则可能扩出其他序列的产物，那么这个引物的特异性就很差，从而 不能用PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h 后带型不规则甚致消失一•假阴性，不出现扩增条带PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的 质量及活性 ④PCR循环条件寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白 质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板吋丢失过多，或 吸入酚。

⑤模板核酸变性不彻底在酶和引物质量好吋，不出现扩增带，极有可 能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消 化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失 或不够而导致假阴性需注意的是有时忘加Taq酶或混乙锭引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩 增条带不理想、容易弥散的常见原因有些批号的引物合成质量有问题，两条引 物一条浓度高，一•条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好 的引物合成单位②引物的浓度不仅耍看0D值，更耍注重引物原液做琼脂糖凝 胶电泳，一定耍有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物 有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决 如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时耍平衡其浓度③引物应高浓度 小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效 ④引物设计不合理，如引物长度不 够，引物Z间形成二聚体等Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR 扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条 带。

反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul> 30uK 50ulo或 lOOul,丿应用多大体积进行PCR扩增，是根据•科研和临床检测不同冃的而设定， 在做小体积如20ul后，再做大体积时，一定耍模索条件，否则容易失败物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极 有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退 火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率有吋还有必要用标准的 温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败 的原因Z—O靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因 靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的1假阳性出现的PCR扩增条带与冃的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高引物设计不合适：选择的扩增序列与非冃的扩增序列有同源性，因而在进行 PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非冃的性的序列靶序列太短或引物太短，容 易出现假阳性需重新设计引物靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大 片段的交叉污染，导致假阳性。

这种假阳性可用以下方法解决：①操作时应小心 轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外②除酶及不能耐高温的物质 外，所有试剂或器材均应高压消毒所用离心管及样进枪头等均应一次性使用 ③必耍吋，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸二是 空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性可互相 拼接，与引物互补后，可扩增岀PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR 方法来减轻或消除2岀现菲特异性扩增带PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异 性扩增带与非特异性扩增带。