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小鼠肝Kupffer细胞分离方法探析.doc

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    • 小鼠肝Kupffer细胞分离方法探析作者:严茂林王耀东田毅峰赖智德周松强邱福南【摘要】 目的探讨分离BALB/c小鼠肝Kupffer细 胞(KC)的方法方法 采用在体酶灌注和离体酶消化、不连 续密度梯度离心、选择性贴壁三步法分离KC,并比较链霉蛋 白酶、IV型胶原酶及联用链霉蛋白酶和IV型胶原酶等3种不 同酶消化分离方法所得KC得率及纯度结果3种不同酶消 化分离方法细胞得率分别为(6. 32±0. 5) X 106 g-1 , (3. 66±0. 4) X106g-l, (10. 3±0. 7) X 106 g-1;细胞纯度 分别为(93. 2± 1.7) %, (90. 7±1.5)%, (94. 5±1.9)%结 论联合链霉蛋白酶和IV型胶原酶在体灌注和离体消化是分 离小鼠KC的较好方法关键词】肝;枯否细胞;离心法,梯密度;小鼠, 近交BABLc ;细胞分离肝Kupffer细胞(Kupffer cell,KC)为定居在肝窦 内的巨噬细胞,约占全身单核巨噬细胞总数的80%〜90% 肝KC能吞噬、杀灭病原微生物,清除体内的内毒素,并具 有抗原递呈、分泌细胞因子等免疫调节作用,同时影响肝细 胞、贮脂细胞及内皮细胞的生物学功能[1]。

      近期发现KC能 诱导同种异体T淋巴细胞凋亡,在调节肝移植免疫耐受中发 挥重要作用[2]如何获得较多数量和较高纯度的KC是研究 其在机体中作用机制的首要条件而传统的分离方法往往因 数量和纯度不足而影响实验结果本试验采用在体酶灌注和 离体酶消化、不连续密度梯度、选择性贴壁三步法分离KC, 探讨分离小鼠肝KC的较好方法1材料与方法1.1材料1. 1. 1实验动物BABL/c小鼠,雄性,10〜12周龄, 清洁级,由四川大学华西医学中心试验动物中心提供(许可 证号:046)试验前禁食12 h,自由饮水,随机分为3组1.1.2主要试剂和仪器IV型胶原蛋白酶、DNAase I、 Percoll及HEPES (美国Sigma公司);兔抗人溶菌酶 (lysozyme,美国DAKO公司);链霉蛋白酶E (瑞士 Roche 公司);RPMI 1640培养基(美国Gibco公司)超净工作台 (苏州净化设备厂),倒置显微镜(日本Nikon公司),低温 高速离心机(美国Beckman公司)1. 1. 3主要液体的配制(1)前灌注液(Hank' s平 衡盐溶液)KC1 5 mmol/L,KH2P04 1 mmol/L,NaCl 115 mmol/L, HEPES 25 mmol/Lo 调整 pH 值为 7.4。

      2)后灌注液 及酶消化液配制后灌注液、酶消化液均由hank? s平衡盐 溶液配制方法1中的后灌注液含0.20%链霉蛋白酶2 mL; 酶消化液:含0. 20%链霉蛋白酶2 mL、0・ 012%DNAase I 2 mL; 方法2中的后灌注液含0. 025%IV型胶原酶2mL酶消化液: 含0・05%IV型胶原酶2 mL;方法3中的后灌注液含0. 05% IV型胶原酶1 mL、0・4%链霉蛋白酶1 mL;酶消化液:含0. 10% IV型胶原酶 ImL.O. 40%链霉蛋白酶 ImL.O. 012%DNAase I 2 mL;1. 1.4 SPS 液的配制 100%Percoll 液和 8. 5%NS 以 9 :1的比例混合,配制成SPS原液;以70%Percol 1液2 mL 配制:SPS 1. 4 mL和PBS0・6mL混合配制所得;30%Percoll 液的配制:PBS 1.4 mL和SPS 0.6 mL混合配制所得1. 1.5RPMI 1640完全培养基的配制 按说明书配制, 0. 22 Um滤器过滤除菌,临用前加入10%新鲜灭活的小牛 血清,青霉素100 U/mL,链霉素100 11 g/mLo1.2 BABL/c小鼠KC分离方法1.2.1原位肝脏灌注步骤参考文献[3]。

      1.2.2肝脏非实质细胞的提取及离心 将上述肝细胞 滤液4 °C离心(800 r/minX8 min),取沉淀加入PBS 4 mL, 4 °C离心(80 r/minX3min),除去沉淀,取上清加入PBS 4 mL充分混匀,再次以4 离心(150 r/minX 8 min), 取沉淀沉淀加入PBS 2 mL,充分混匀取10 mL离心管1 支,依次加入70%Percoll、30%Percoll、纟田胞悬液各2 mL 及少许PBS, 4 °C离心(1 600 r/minX22 min)离心管自 上而下依次为:细胞碎片、30%Percoll层、30 % Per co 11 层与70%Percoll层之间的是大量KC及少量肝窦内皮细胞、 70%Percoll层、离心管底层为少许红细胞取30%Percoll 和70%Percol 1层之间的白色物,PBS 8 mL稀释细胞,4匸 离心 1 次(600 r/minX8min), 4 °C分别离心(150 r/minX8 min) 2次,除去上清1.2.3 KC贴壁培养 将上述细胞沉淀用适量10%胎牛 RPMI 1640稀释,取10 uL用台盼蓝染色检测细胞活性及细 胞计数,分别计算3种方法的KC得率及纯度。

      于37 °C.体 积分数为0.05的C02孵箱中培养4〜6 h后更换培养液, 去除非贴壁细胞,贴壁细胞即为试验所需的KC分别于1, 24, 48 h下观察细胞形态及贴壁情况1.3 KC的鉴定1.3. 1荧光显微镜观察 将KC悬液滴于细胞玻片上,328 nm激发光,荧光显微镜下观察细胞自发荧光情况1.3.2吞噬试验KC分别培养6, 24 h后,加入50% 碳素墨水2 mL 2 h后,洗涤细胞以除去未吞噬的碳素颗粒, 倒置显微镜下观察细胞吞噬情况1.3.3免疫组织化学染色 常规免疫组织化学染色, 一抗为兔抗大鼠1 ysozyme,每次试验均设置阴性对照组,以 0.01 mmol/L PBS 代替一抗1.4统计学处理计量数据以x土s表示,采用SPSS 11. 5统计软件分析组间差异用单因素方差分析,以P<0. 05 为差别有统计学意义2结果2. 1荧光显微镜观察 在328 nm荧光激发下,未见KC 发出荧光2. 2KC的形态变化 新鲜分离的KC呈圆形,细胞核大, 细胞质少,折光性较强,远小于肝细胞,接种lh后少部分 细胞已贴壁;培养24h后,多数细胞已伸展;培养48h后, 绝大多数细胞已贴壁,且充分伸展,可见星形或不规则形; 方法3所得KC培养24 h后的细胞贴壁及形态情况(图1A)。

      KC:肝Kupffer细胞.A:KC培养24 h后的形态(X 10); B: KC培养6 h后吞噬试验(X10); C: KC培养48 h后免 疫组织化学图像(X20).图1KC培养24h后的形态、6 h后的吞噬试验、48 h 后的免疫组织化学表现(略)Fig 1 Morphous of KC after 24 hours culture, the phagocytosis test of KC after 6 hours culture, iinmunohis to chemi s try of KC after 48 hours culture2.3 3种方法分离的KC活力、得率及纯度情况(表1) 表13种分离方法细胞得率及细胞纯度的比较(略)Tab 1 Comparison the yield and purity of KC in three separation methodsn=10.与方法1比较,△: P<;0. 05;与方法2比 较,#: P<;0. 05;与方法 1 比较,☆: P<;0. 05・2.4吞噬试验KC分别培养6 h,再与碳素墨水颗粒 培养2h,可见KC内吞噬大量碳素墨水颗粒(图IB)。

      2.5免疫组织化学染色KC培养48h后,免疫组织化 学染色显示细胞内溶菌酶96%以上为阳性染色,细胞内呈棕 黄色(图1C),证实所分离贴壁细胞为KC3讨论目前分离肝脏非实质细胞的方法主要有密度梯度离 心法、离心淘析法及将两者相结合的方法Valatas等先用 密度梯度法将死亡的肝细胞与肝非实质细胞分离,然后利用 离心淘析法分离大鼠KC,进一步利用选择性贴壁纯化KC, 获得较好的细胞得率和纯度[4]由于离心淘析法设备昂贵, 难以在一般试验室推广本实验利用联合酶在体和离体灌注、密度梯度离心和选择性贴壁法,具有以下优点:(1) IV 型胶原酶和链霉蛋白酶的用量少以相同体质量的肝组织计IV型胶原酶的使用量仅仅相当于Jiang等用量的1/50[2]; (2)细胞得率、纯度相对较高本实验注重在体灌注和酶的联合应用,提高酶的效率;(3)灌注时间较短, 污染机会较少;(4)操作方便,无需特殊设备与其他方法 相比较[3,5 7],本实验方法同样取得与其相当的细胞得率 和纯度,且节省分离时间和酶用量本实验系统地比较了 3种不同分离方法的KC细胞纯 度和得率,结果显示,联合链霉蛋白酶与IV型胶原酶在体灌 注和体外消化所获得的KC纯度和得率均较为理想。

      方法3 同时使用了 3种酶,其中链霉蛋白酶裂解肝细胞,IV型胶原 酶解除肝非实质细胞间的连接,DNA酶降解DNA,从而形成 较为完全的单细胞悬液,比其他2种方法获得较高的细胞得 率方法2由于没有使用链霉蛋白酶,肝细胞破坏较少,形 成的单细胞悬液较为不完全,所以细胞纯度及细胞得率较 低方法1使用了链霉蛋白酶和DNA酶,减少了絮状物的形 成,相对方法2所获得的细胞得率较高门静脉插管是完成在体灌注的关键首先使门静脉保持一定张力,从肠系膜上静脉处沿门静脉方向呈15进针, 使针尖超过脾静脉入口,然后用血管夹夹闭以阻断入肝血 流同时灌注时应排尽针管空气,防止血管空气栓塞导致肝 组织消化不良另外笔者术中采用血管夹以固定头皮针,防 止针管移动和滑脱,同时防止灌注液的流失和停止灌注时肠 系膜上静脉及脾静脉的血液回流,是在体灌注顺利完成的关 键笔者认为KC得率影响因素主要有以下几点:(1)门 静脉灌注良好与否是影响肝KC得率的关键,这与其它学者 报道一致[31; (2)消化不完全时,难以获得完全的单细胞 悬液,含有KC的组织被滤网滤除或离心时丢失,细胞不纯 会进一步影响KC贴壁联合链霉蛋白酶和IV型胶原酶离体 消化能获得较为完全的单细胞悬液[8]; (3)用链霉蛋白酶E 消化后,细胞悬液中很快出现絮状物。

      絮状物中会网络较多 KC,影响离心过程中KC的分离加用DNA酶I能有效防止 絮状物的形成,提高细胞得率;(4)在贴壁时间相同的情况 下,KC的纯度和数量是相互矛盾的参考文献】[1] Winwood P J, Arthur M J. Kupffer cell: Their activation and role in animal models of liver injury and human liver disease[J]・ Semir Liver Dis, 1993,13(1): 50 59.[2] Sun Z L, Wada T, Maemura K, et al. Hepaticallograft derived kupffer cells regulate T cellresponse in rats [J]・ Liver transplantation,2003,9(5): 489 497.[3] Jiang J X, Zhang Y, Ji S H, et al. Kinetics of mitogen activated protein kinase faily in lipopolysaccharide stimulated mouse kupffer cells a。

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