碱性磷酸酶检测.ppt

1　　血清碱性磷酸酶活性测定血清碱性磷酸酶活性测定（磷酸苯二钠法）（磷酸苯二钠法）2实验目的实验目的•熟悉酶活性检测的意义熟悉酶活性检测的意义•熟悉血清熟悉血清ALP活性测定方法活性测定方法(磷酸苯二钠法磷酸苯二钠法)•掌握血清掌握血清ALP活性测定的临床意义活性测定的临床意义3实验原理实验原理• 酶活性酶活性：酶催化某一化学反应的能力，常用单位时间内产物的：酶催化某一化学反应的能力，常用单位时间内产物的生成量生成量( (即即酶促反应速度酶促反应速度) )来表示酶活性大小来表示酶活性大小• 终止测定法终止测定法( (或定时法或定时法): ): 在酶作用一段时间后，加入强酸、在酶作用一段时间后，加入强酸、强碱、蛋白沉淀剂等终止酶促反应，测定这段时间内产物的生成强碱、蛋白沉淀剂等终止酶促反应，测定这段时间内产物的生成量，计算酶促反应的平均速度，得到酶活性值量，计算酶促反应的平均速度，得到酶活性值• 连续监测法连续监测法: : 每隔一定时间每隔一定时间( (2-60s) )，连续测定产物量随时间，连续测定产物量随时间变化的情况，求出酶反应初速度，间接得到酶活性值该方法适变化的情况，求出酶反应初速度，间接得到酶活性值。

该方法适用于自动生化分析仪，成为临床测定酶活性浓度最常用的方法用于自动生化分析仪，成为临床测定酶活性浓度最常用的方法4ü 酶活性检测的影响因素酶活性检测的影响因素Ø 合适的底物与最适底物浓度，合适的底物与最适底物浓度，[S]>>[E总总]Ø 理想的缓冲液与最适离子强度理想的缓冲液与最适离子强度Ø 合适的辅因子、激活剂浓度合适的辅因子、激活剂浓度Ø 合理的测定时间合理的测定时间(?)Ø 最适温度最适温度(?)Ø 最适最适pH (?)56碱性磷酸酶碱性磷酸酶ALP (Alkaline phosphatase)• ALP几乎存在于机体各个组织，以骨骼、牙齿、肝脏和肾脏中含几乎存在于机体各个组织，以骨骼、牙齿、肝脏和肾脏中含量较多，儿童的量较多，儿童的ALP活性高于成人活性高于成人• 临床测定临床测定ALP活性主要用于肝脏疾病和骨骼疾病诊断活性主要用于肝脏疾病和骨骼疾病诊断.Ø 生理性增加生理性增加: 儿童、孕妇及进食高脂食物可使血清儿童、孕妇及进食高脂食物可使血清ALP活性增高活性增高.Ø 病理性增加病理性增加: (1) 肝胆疾病阻塞性黄疸、黄疸性肝炎和肝癌等，尤以癌性梗阻最明显。

肝胆疾病阻塞性黄疸、黄疸性肝炎和肝癌等，尤以癌性梗阻最明显2) 各种骨骼疾病佝偻病、纤维性骨病、成骨不全症、骨转移癌和骨折修复各种骨骼疾病佝偻病、纤维性骨病、成骨不全症、骨转移癌和骨折修复愈合期等愈合期等Ø 病理性降低病理性降低: 呆小症、磷酸酶过少症等呆小症、磷酸酶过少症等7磷酸苯二钠法磷酸苯二钠法在在pH=10条件下，条件下，ALP可催化磷酸苯二钠水解生成苯酚和磷酸氢二可催化磷酸苯二钠水解生成苯酚和磷酸氢二钠苯酚在碱性溶液中与钠苯酚在碱性溶液中与4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化生氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化生成醌衍生物，根据红色深浅可测定酶活性的大小成醌衍生物，根据红色深浅可测定酶活性的大小 K3Fe(CN)6ü 金氏单位金氏单位(King’s unit): 在在37℃条件下，每条件下，每100 mL血清与底物作用血清与底物作用15分钟，产分钟，产生生1mg酚的酚的ALP活性为活性为1个金氏单位个金氏单位8实验步骤实验步骤TSBC血清血清 (mL)0.1———酚标准液酚标准液 (mL)—0.1——蒸馏水蒸馏水 (mL)——0.1—碳酸盐缓冲液碳酸盐缓冲液 (mL)1.01.01.01.0混匀混匀, 37℃水浴保温水浴保温5分钟，同时将底物液预热分钟，同时将底物液预热底物液底物液 (mL)1.01.01.01.0混匀混匀, 37℃水浴准确保温水浴准确保温15分钟分钟铁氰化钾溶液铁氰化钾溶液 (mL)3.03.03.03.0血清血清 (mL)———0.1立即混匀，以蒸馏水调零点，在立即混匀，以蒸馏水调零点，在510 nm处读取各管吸光度。

处读取各管吸光度ü 参考值参考值: 成人为成人为3-13个金氏单位，儿童为个金氏单位，儿童为5-28个金氏单位个金氏单位ü 计算计算:9讨论讨论1. 分析各个试管的功用？2. 分析公式中各个数值的意义？3. 讨论实验操作中两个时间的意义以及精确性。