生活力的四唑测定.pdf

1 第十四章生活力的四唑测定 实际工作中如种子贸易时常需要在短时间内掌握种子批的生活力状况，如果种子处于休眠状 态则难以通过发芽测定得到结果 种子生活力测定可以满足这一需要，四唑测定可以测定出休眠种子样品的生活力百分率 四唑测定方法于 1942年由德国的 G. Lakon 教授发明，第 2 次世界大战期间传入美国 随着四 唑测定技术的发展， ISTA(国际种子检验协会 )于 1950 年成立四唑测定技术委员会，致力于种 子四唑测定技术的发展 2003 年出版《 ISTA 四唑测定工作手册》 ，列有 120 种农业和 122 种林业种、属的四唑测定方 法 第一节概述 一、生活力概念 种子生活力（ seed viability）是种子发芽的潜在能力或种胚具有的生命力 第一节概述 二、种子生活力测定的意义 1. 可以测定休眠种子的生活力 2.快速预测种子发芽能力 种子贸易中，常因时间紧迫，不可能采用正规的发芽试验来测定发芽力，这是因为发芽试验 所需的时间更长 林木种子可用生活力代替发芽力 第一节概述 三、四唑染测定的原理 在种子组织活细胞内脱氢酶的作用下，无的氯化三苯基四氮唑，接收活种子代谢过程中呼 吸链上的氢，在活细胞里变成还原态的红、稳定、不扩散的三苯基甲 月替 (Triphenyl Formazam) 。

可根据四唑染成的颜和部位， 区分种子红的有生活力部分和无的死亡部分 2，3，5-氯化三苯基四氮唑三苯基甲月替 (无) (红 ) 第一节概述 种子有无生活力主要取决于胚和(或)胚乳(或配子体 )坏死组织的部位和面积的大小，而不一定 在于颜的深浅颜的差异主要是将健全的、衰弱的和死亡的组织判别出来根据以上理 由和所用指示剂， 把这种测定称为“局部解剖形的四唑测定” (topographical tetrazolium test) 这就是说，是根据种子胚和活营养组织局部解剖染部位及颜状况，鉴定种子胚的死亡部 分，查明种子死亡的原因 第一节概述 四、四唑测定适用的范围 收获后需马上播种的种子； 具有深休眠的种子； 发芽缓慢的种子； 要求估测发芽潜力的种子 另外，也适用于测定发芽末期个别种子的生活力，特别是怀疑有休眠时；测定已萌发种子， 或收获期间存在的不同类型和/或加工的损伤（热害、机械损伤或虫蛀等）种子；解决发芽试 验中存在的问题，如不清楚不正常幼苗产生的原因或怀疑杀菌剂的处理效果等 第一节概述 五、四唑测定方法的特点 四唑测定是一种世界公认、广泛应用、实用方便、省时快速、结果可靠的种子生活力检验方 法。

具体地说具有以下几个特点：2 1.原理可靠，结果准确 如能正确使用四唑测定方法，四唑测定结果与发芽率误差一般不会超过3%～5% 2.不受休眠限制 3.方法简便、省时快速 4.成本低廉四唑测定也有其缺陷：如对种子检验员经验和技能要求较高；结果不能提供休眠的程度；处 理种子不会像发芽试验能反映药害情况 第二节试剂的配制和仪器设备 一、试剂的配制 1．四唑溶液 2．磷酸缓冲液 3．乳酸苯酚透明液 采用乳酸苯酚透明液，是使小粒豆类和牧草种子经四唑染后使种皮、稃壳或胚乳变为透明, 以便透过这些部分清楚地观察其胚主要构造的染情况 第二节试剂的配制和仪器设备 二、仪器和设备 四唑测定的主要仪器设备与发芽试验设备相同，可采用其设备：如电热恒温箱或发芽箱、冰 箱 四唑测定需配备的小器具有：种子切割工具如解剖刀或刀片、小针、切割垫板等；种子预湿 需要纸、毛巾、烧杯等器具；染时，要准备有盖的不同规格的染盘、棕加液器、镊子、 吸管等；观察器具如体视显微镜或放大镜；以及保护器具如手套、眼睛保护镜、废液处理容 器等 第三节四唑测定程序 一、试验样品的来源数取 试验样品来源必须是净种子净种子可以从净度分析后的净种子中随机数取，也可以从送验 样品中直接随机数取。

一般随机数取100 粒种子， 2～4 个重复或少于 100粒的若干副重复 如果是测定发芽末期休眠种子的生活力，则可单用试验末期的休眠种子 委托检验可以直接从经充分混合的种子样品中随机数取种子 第三节四唑测定程序 二、种子预处理 在正式测定前， 对所测种子样品需经过预处理（预措预湿），其主要目的是使种子加快和充分 吸湿，软化种皮，方便样品准备和促进活组织酶系统的活化，以提高染的均匀度、鉴定的 可靠性和正确性 第三节四唑测定程序 预措---是指在种子预湿前除去种子的外部附属物和在种子非要害部位弄破种皮，如水稻种子 需脱去内外稃壳，豆科硬实种子刺破种皮等，但须注意，预措不能损伤种子内部胚的主要构 造绝大多数种子不须进行预措处理，但有一些种子在预湿前要进行预措处理 预湿是四唑染测定的必要步骤预湿方法目前常用的有以下两种方法： 第三节四唑测定程序 1．缓慢润湿 缓慢润湿是按种子发芽试验所采用方法，将种子放在纸床上或纸巾间，让其缓慢吸湿该法 适用于那些直接浸在水中容易破裂和损伤的种子，以及已经劣变的种子或过分干燥的种子 缓慢润湿可采用下面两种方法： ①纸卷或纸间预湿 ②纸床上预湿3 第三节四唑测定程序 2．水中浸渍 水中浸渍是将种子完全浸入水中，种子吸水快、均匀，并可缩短预湿时间。

该法适用于种子 直接浸入水中不会造成组织破裂损伤，并不会影响鉴定结果的种子种类，包括水稻、小麦、 大麦、燕麦、黑麦草、黑麦、玉米等，详见表 14-l浸种温度一般采用20～30℃或 30℃水温 第三节四唑测定程序 三、染前的样品准备 为了使四唑溶液快速和充分渗入种子的全部活组织，加快染反应和正确鉴定胚的主要构造， 大多数种子在染前必须采用适当的方法使胚的主要构造和(或)活的营养组织暴露出来 第三节四唑测定程序 1．不须样品准备 种皮渗水性良好的豆类种子，在四唑溶液里染时，就能随着四唑溶液的渗入而吸胀，并在 染后剥去种皮就可正确鉴定，这类种子不须样品准备 2．沿胚纵切3．近胚纵切 第三节四唑测定程序 4．上半粒纵切 5．斜切种子 6．剥去种皮 7．横切胚轴和盾片 8．平切果种皮和胚乳，暴露出胚的构造 9．穿刺或切开胚乳 10．切去种子基端 11．横切胚乳 14-1 一些常见作物种子的准备示意 1．禾谷类和禾本科牧草种子通过胚和约在胚乳四分之三处纵切 2．燕麦属 (Avena)和禾本科牧草种子靠近胚部横切 3．禾本科牧草种子通过胚乳末端部分横切和纵切 4．禾本科牧草种子刺穿胚乳 5．通过子叶末端一半纵切，如莴苣属(Lactuca)和菊科 (Asteraceae) 中的其他属。

6．纵切面表明似上述第5 种方式进行纵切时的解剖刀部位沿胚的旁边纵切 [伞形科 (Apiaceae)中的种和其他具有直立胚的种] 8．针叶树种子沿胚旁边纵切 9．在两端横切，打开胚腔，并切去小部分胚乳(配子体组织 )o 第三节四唑测定程序 四、四唑染 四唑溶液必须完全淹没种子，溶液不能直接露光，因为光线可能使四唑盐类还原而降低其浓 度，影响染效果 按表 14-1（GB/T 3543.7-1995 表 1）的要求，将经过样品准备或不须准备的规定数量种子分 别放入四唑溶液里染 小粒种子可用直径6cm培养皿， 大、中粒种子可用 9cm 培养皿或更 大的容器， 特别细小的种子可包在滤纸内，分别放入容器里 然后加入适宜浓度的四唑溶液， 移置一定温度的恒温箱内进行染反应 第三节四唑测定程序 五、鉴定前处理 为了确保鉴定结果的正确性，还应将已染的种子样品，加以适当的处理，再进一步使胚的4 主要构造和活的营养组织明显地暴露出来，以便观察鉴定 1．不须处理，直接观察 适用于染前已进行样品准备的整个胚、摘出的胚中轴、纵切或横切的胚等样品因为这些 种子胚的主要构造已暴露在外面，所以不须附加处理，就可直接观察鉴定。

第三节四唑测定程序 2．轻压出胚，观察鉴定 3．扯开营养组织，暴露出胚 4．切去一层营养组织，暴露出胚和活营养组织 5．沿胚中轴纵切，暴露胚的构造 6．沿种子中线纵切，暴露出胚和活营养组织 第三节四唑测定程序 7．剥去半透明的种皮或种子组织，暴露出胚 8．切去切面碎片或掰开子叶，暴露出胚 9．剥去种皮和残余营养组织，暴露出胚 10．乳酸苯酚透明液的应用 加入 2—4 滴乳酸苯酚透明液， 适当摇晃，使其与种子良好接触， 38℃恒温箱保持 30～60min， 经清水漂洗或直接观察 第三节四唑测定程序 六、观察鉴定 一般鉴定原则是，凡是胚的主要构造及有关活营养组织染成有光泽的鲜红，且组织状态正 常的，为有生活力种子 凡是胚的主要构造局部不染或染成异常的颜和光泽，并且活营养组织不染部分已超过 二分之一， 或超过容许范围， 以及组织软化的， 完全不染或染成无光泽的淡红或灰白， 且组织已软化腐烂或异常、虫蛀、损伤的均为无生活力种子 14-2 玉米种子四唑染谱 1.有生活力——胚全染成深红2.有生活力——仅盾片两端少部不染3.有生活力 --- 仅盾 片先端及胚芽鞘先端及少部不染4.有生活力——胚芽鞘先端不染.5.有生活力—胚芽鞘先 端及胚根顶端 2／3 以下不染， 种子根区染 6.无生活力——胚根大部不染，已波及种子 根区。

7.无生活力——胚芽全不染8.无生活力——胚轴不染9.无生活力—盾片与胚轴 连接处不染 10.无生活力——盾片两端不染部份已超过1／211.无生活力——盾片1 ／2 以上不染 12.无生活力——胚全不染 14-3 水稻种子四唑染谱 1.有生活力——胚全染成深红（不染部分属胚芽鞘和盾片间隙）2.有生活力——盾片先端 染稍浅 3.有生活力 ---盾片先端及胚芽鞘先端不染4.无生活力——胚根全不染.5.无生 活力—胚芽先端、 胚芽鞘及盾片先端染较浅6.有生活力——胚全染成红7.有生活力— —盾片全部染， 胚根胚芽鞘部分染较浅 8.无生活力—盾片全不染 9.无生活力——胚 大部分染较浅 10.无生活力——胚全不染 14-4 棉花种子四唑染谱 1.有生活力——染后将子叶分开的胚可见两片子叶及怔根均染成红2.有生活力——胚全 染成深红3.无生活力——胚根中段不染4.无生活力——子叶关键部位不染5.无生 活力——子叶基部不染 6.无生活力——胚根中部很长一段不染7.无生活力——胚根先 端不染， 子叶内部大部染很浅 8.无生活力——子叶大部不染9.无生活力——胚全不 染 14-5 番茄种子四唑染谱 1.有生活力——胚全染。

2.无生活力——胚根基部及子叶先端不染或染很淡3.无生活 力一—子叶基部不染 4.无生活力——子叶大部染很淡5.无生活力——子叶全不染5 6.无生活力——胚根先端明显不染7.无生活力——胚的中段， 包括胚轴及与之相连的胚根 及子叶均不染 8.无生活力——胚全不染 14-6 辣椒种子四唑染谱 1.有发芽力——胚全染 2.有发芽力——片子叶顶端约1／2 不染，另一片全染3.无 发芽力—胚根先端不染，子叶中部有一小段染很浅4.无发芽力——子叶中段不染 5.无发芽力——子叶全不染6.无发芽力——子叶基部—端不染7.无发芽力——胚多处 不染 8.无发芽力——胚全不染 14-7 油菜种子四唑染谱 1、2.有生活力——胚全染成深红3.有生活力 ---子叶顶端有小于1/3 不染 4.无生活力— —胚根先端及侧面有大于直径1/4 的不染 .5.无生活力—胚根基部不染，子叶极小部分不 染 6.无生活力——胚根一侧约1/2 不染 7.无生活力——胚根大部分不染8.无生活力 ——子叶与胚轴相连处不染9.有生活力—外方一枚子叶非关键部位部分不染10.无生 活力——外方一枚子叶染很浅11.无生活力——仅子叶的一部分染成浅红，。