实训三胰蛋白酶的制备及活力的测定.doc

实训三实训三 胰蛋白酶的制备及活力的测定胰蛋白酶的制备及活力的测定 目的要求目的要求 1．学习胰蛋白酶的纯化及其结晶的基本方法 2．了解酶的活性与比活性的概念实验原理实验原理 胰蛋白酶是以无活性的酶原形式存在于动物胰脏中，在 Ca2+的存在下，被肠激酶或有 活性的胰蛋白酶自身激活，从肽链 N 端赖氨酸和异亮氨酸残基之间的肽键断开，失去一段 六肽，分子构象发生一定改变后转变为有活性的胰蛋白酶 胰蛋白酶原的分子量约为 24000，其等电点约为 pH8.9，胰蛋白酶的分子量与其酶原接 近（23300），其等电点约为 pH10.8，最适 pH7.6～8.0，在 pH=3 时最稳定，低于此 pH 时， 胰蛋白酶易变性，在 pH>5 时易自溶Ca2+离子对胰蛋白酶有稳定作用 重金属离子，有机磷化合物和反应物都能抑制胰蛋白酶的活性，胰脏、卵清和豆类植物的 种子中都存在着蛋白酶抑制剂最近发现在一些植物的块基（如土豆、白薯、芋头等）中 也存在有胰蛋白酶抑制剂 胰蛋白酶能催化蛋白质的水解，对于由碱性氨基酸（精氨酸、赖氨酸）的羧基与其他 氨基酸的氨基所形成的键具有高度的专一性此外还能催化由碱性氨基酸和羧基形成的酰 胺键或酯键，其高度专一性仍表现为对碱性氨基酸一端的选择。

胰蛋白酶对这些键的敏感 性次序为：酯键> 酰胺键> 肽键因此可利用含有这些键的酰胺或酯类化合物作为底物来 测定胰蛋白酶的活力目前常用苯甲酰-L-精氨酸-对硝基苯胺（简称 BAPA）和苯甲酰-L- 精氨酸-β-萘酰胺（简称 BANA）测定酰胺酶活力用苯甲酰-L-精氨酸乙酯（简称 BAEE） 和对甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯（简称 TAME）测定酯酶活力本实验以 BAEE 为底物，用紫外 吸收法测定胰蛋白酶活力酶活力单位的规定常因底物及测定方法而异 从动物胰脏中提取胰蛋白酶时，一般是用稀酸溶液将胰腺细胞中含有的酶原提取出来， 然后再根据等电点沉淀的原理，调节 pH 以沉淀除去大量的酸性杂蛋白以及非蛋白杂质，再 以硫酸铵分级盐析将胰蛋白酶原等（包括大量的酸性杂蛋白以及非蛋白杂质，再以硫酸铵 分级盐析将胰蛋白酶原等（包括大量糜蛋白酶原和弹性蛋白酶原）沉淀析出经溶解后， 以极少量活性胰蛋白酶激活，使其酶原转变为有活性的胰蛋白酶（糜蛋白酶和弹性蛋白酶 同时也被激活），被激活的酶溶液再以盐析分级的方法除去糜蛋白酶及弹性蛋白酶等组分 收集含胰蛋白酶的级分，并用结晶法进一步分离纯化一般经过 2～3 次结晶后，可获得相 当纯的胰蛋白酶，其比活力可达到 8000～10000BAEE 单位/毫克蛋白，或更高。

如需制备更纯的制剂，可用上述酶溶液通过亲和层析方法纯化试剂和器材试剂和器材 1 1．试剂．试剂 （1）pH2.5 乙酸酸化水 （2）2.5mol/L H2SO4 （3）5 mol/L NaOH （4）2 mol/L NaOH （5）2mol/L HCl （6）0.001M HCl （7）硫酸铵8）氯化钙 （9）0.8 mol/L pH9.0 硼酸缓冲液：取 20ml 0.8 mol/L 硼酸溶液，加 80ml 0.2 mol/L 四 硼酸钠溶液，混合后，用 pH 计检查校正 （10）0.4 mol/L pH9.0 硼酸缓冲液（用 0.8 mol/L 稀释 1 倍即可）； （11）0.2 mol/L pH8.0 硼酸缓冲液：取 70ml 0.2 mol/L 硼酸溶液，加 30ml 0.5 mol/L 四硼酸钠溶液，混合后，用 pH 计校正 （12）0.05 mol/L pH8.0 Tris－HCl 缓冲液：取 50mL 0.1 mol/LTris 加 29.2 mL mol/L HCl 加水定容至 100mL （13）底物溶液的配制：即每毫升 0.05 mol/L pH8.0 Tris－HCl 缓冲液中加 0.34mgBAEE 和 2.22mg 的氯化钙。

2 2、器材、器材 （1）新鲜或冰冻猪胰脏 （2）食品加工机和高速分散器 （3）研钵 （4）大玻璃漏斗 （5）布氏漏斗 （6）抽滤瓶 （7）纱布 （8）恒温水浴 （9）紫外分光光度计 （10）秒表 （11）pH 试纸操作方法操作方法 1 1．猪胰蛋白酶制备．猪胰蛋白酶制备 （1）猪胰蛋白酶原的提取 猪胰脏 1.0Kg（新鲜的或杀后立即冷藏的），除去脂肪和结缔组织后，绞碎 加入 2 倍体积预冷的乙酸酸化水（pH2.5）于 10～15℃搅拌提取 24 小时，四层纱 布过滤得乳白 色滤液，用 2.5M H2SO4调 pH 至 2.5～3.0，放置 3～4 小时后用折迭滤纸过滤得黄色透明滤 液（约 1.5L） 加入固体硫酸铵（予先研细），使溶液达 0.75 饱和度（每升滤液加 492 克）放置过 夜后抽滤（挤压干），得猪胰蛋白酶原粗制品 （2）胰蛋白酶原激活 向胰蛋白酶原粗制品滤饼分次加入 10 倍体积（按饼重计）冷的蒸馏水，使滤饼溶 解，得胰蛋白酶原溶液将研细的固体无水氯化钙慢慢加入酶原溶液中（滤饼中硫酸铵的 含量按饼重的四分之一计），使 Ca2+与 SO42-结合后，边加边搅拌均匀，边加边搅拌，使溶 液中最终仍含有 0.1M CaCl2。

用 5M NaOH 调 pH 至 8.0，加入极少量猪胰蛋白酶（约 2-5mg）轻轻搅拌，于室温下活 化 8～10h，（2～3 小时取样一次，并用 0.001M HCl 稀释），测定酶活性增加的情况 活化完成（排毒养颜胶囊比活约 3500～4000BAEE 单位）后，用 2.5M H2SO4调 pH 至 2.5～3.0，抽滤除去 CaSO4 沉淀 （3）胰蛋白酶的分离 将已激活的胰蛋白酶溶液按 242g/L 加入细粉状固体硫酸铵，使溶液达到 0.4 饱和度， 放置数小时后，抽滤，弃去滤饼2．滤液按 250g/L 加入研细的硫酸铵，使溶液饱度达到 0.75，放置数小时，抽滤，弃去滤 液 （4）胰蛋白酶的结晶 将上述胰蛋白酶滤饼（粗胰蛋白酶）溶解后进行结晶：按每克滤饼溶于 1.0ml pH9.0 的 0.4M 硼酸缓冲液的量计加入缓冲液，小心搅拌溶解 用 2M NaOH 调 pH 至 8.0，注意要小心调节，偏酸不易结晶，偏碱易失活，存放于冰箱 放置数小时后，应出现大量絮状物，溶液逐渐变稠呈胶态，再加入总体积的 1/4～1/5 的 pH8.0 的 0.2M 硼酸缓冲液，使胶态分散，必要时加入少许胰蛋白酶晶体。

放置 2～5 天可得到大量胰蛋白酶结晶，待结晶析出完全时，抽滤，母液回收 （5）胰蛋白酶的重结晶 将第一次结晶的胰蛋白酶产物进行重结晶：用约 1 倍的 0.025M HCl，使上述结晶分散， 加入约 1.0～1.5 倍体积的 pH9.0 的 0.8M 硼酸缓冲液，至结晶酶全部溶解，取样后，用 2M NaOH 调溶液 pH 至 8.0（准确）（体积过大，很难结晶），冰箱放置 1～2 天，可将大量结 晶抽滤得第二次结晶产物(母液回收)，冰冻干燥后得重结晶的猪胰蛋白酶 2 2．胰蛋白酶活性的测定．胰蛋白酶活性的测定 以苯甲酰 L—精氨酸乙酯（英文缩写为 BAEE）为底物，用紫外吸收法进行测定苯甲 酰 L—精氨酸乙酯在波长 253nm 下的紫外吸收远远弱于苯甲酰 L—精氨酸（英文缩写为 BA）在胰蛋白酶的催化下，随着酯键的水解，苯甲酰 L—精氨酸逐渐增多，反应体系的 紫外吸收宜随之相应增加 取 2 个光程为怎么减肚子 1 厘米的带盖石英比色杯，分别加入 25℃予热过的 2.8ml 底 物溶液向一只比色杯中加入 0.2ml 0.001mol/L HCl，作为空白，校正仪器的 253nm 处光 吸收零点。

再在另一比色杯中加入 0.2ml 待测酶液（用量一般为 10 微克结晶的胰蛋白酶）， 立即混匀并记时，每半分钟读数一次，共读 3～4min控制 DA253/min 在 0.05 ～ 0.100 左右为宜 绘制酶促反应动力学曲线，从曲线上求出反应起始点吸光度随时间的变化率（即初速度） DA253/min 胰蛋白酶活力单位的定义规定为：以 BAEE 为底物反应液 pH8.0，25℃，反应体积 3.0ml，光径 1 厘米的条件下，测定 DA253，每分钟使 DA253 增加 0.001，反应液中所加入 的酶量为一 BAEE 单位胰蛋白酶溶液的活力单位（BAEE 单位/ mL）＝胰蛋白酶比活力（BAEE 单位 / mg ）＝注意事项注意事项 1．胰脏必需是刚屠宰的新鲜组织或立即低温存放的，否则可能因组织自溶而导致实验失败2．在室温 14～20℃条件下 8～12h 可激活完全，激活时间过长，因酶本身自溶而会使比活 降低，比活性达到“3000～4000BAEE 单位/mg 蛋白”时即可停止激活 3．要想获得胰蛋白酶结晶，在进行结晶时应十分细心地按规定条件操作，切勿粗心大意， 前几步的分离纯化效果愈好，则培养结晶也较容易，因此每一步操作都要严格。

酶蛋白溶液过稀难形成结晶，毛孔大怎么办过浓则易形成无定形沉淀析出，因此，必需恰到好处， 一般来说待结晶的溶液开始时应略呈微浑浊状态 4．过酸或过碱都会影响结晶的形成及酶活力变化，必须严格控制 PH 5．第一次结晶时，3～5 天后仍然无结晶，应检查 pH，必要时调整 pH 或接种，促使结晶形 成重结晶时间要短些思考题思考题 1．提取制备猪胰蛋白酶的过程中，应特别注意哪些主要环节和影响因素？ 2．PH 值在制备中起到什么作用？ 3．哪些因素是直接影响形成晶体的主要原因？应该注意哪些条件？ 4．在实验中，岳阳家政可以采取什么方法来提高产率和比活率？。