2015-《中国药典》无菌检查法修订解析.ppt

中国药典2015年版无菌检查法的增修订内容 1、无菌 是指某一物体或某一环境中不含有活的微生物2、无菌检查法 用于检查药典要求无菌的药品、生物制品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法3、无菌操作 是指在无菌环境条件下，在对无菌制品或无菌器械等进行检验的过程中，能防止微生物污染与干扰的一种常规操作方法4、无菌技术 是指在微生物试验工作中，控制或防止各类微生物的污染及其干扰的一系列操作方法和有关措施，其中包括无菌环境设施、无菌试验器材及无菌操作5、无菌检查法的局限性 若供试品符合无菌检查法的规定,仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染也就是无菌试验并不能用于保证整批产品的无菌性，但是它可用于确定批产品不符合无菌要求 灭菌产品的无菌保证不能依赖于最终产品的无菌检验，它是作为确定批无菌产品是否无菌的一个检验项目，而产品的无菌保证要取决于生产过程中采用合格的灭菌工艺、良好的无菌保证体系和严格的GMP管理 1.理论上的局限性 2.统计概率的局限性 3.检验条件的局限性 主要内容我国药典无菌检查法的历史发展我国药典无菌检查法与欧美药典的差异中国药典2015年版通则（1101）无菌检查法的增修订内容2015版《中国药典》无菌检查法医院制剂进行微生物控制的必要性 　　 修修订时间修修订内容内容19531953年版年版直接接种法直接接种法 无阳性无阳性对照菌照菌取样量取样量2 2支支/ /瓶瓶 19631963年版年版直接接种法直接接种法 三种培养基培养基三种培养基培养基 阳性阳性对照－金葡照－金葡19771977年版年版直接接种法直接接种法增加了薄膜过滤法（抗生素）。

增加了薄膜过滤法（抗生素）阳性阳性对照－金葡照－金葡19851985年版年版直接接种法直接接种法薄膜过滤法限培养基为需、厌气菌培养基及霉菌培养基薄膜过滤法限培养基为需、厌气菌培养基及霉菌培养基阳性阳性对照－金葡照－金葡19901990年版年版同同19851985年版年版19951995年版年版培养基培养基灵敏度灵敏度检查－藤黄、－藤黄、 生生孢、白念阳性、白念阳性对照：金葡照：金葡1010－－6 6 ；生；生孢1010－－6 6 ；白念；白念1010－－5 519981998年年阳性阳性对照：金葡照：金葡1010－－6 6 ；生；生孢1010－－6 6 ；白念；白念1010－－5 520002000年版年版实验环境为实验环境为100100级洁净度要求全过程防止微生物污染，检验量级洁净度要求全过程防止微生物污染，检验量6 6～～1111支支/ /瓶；瓶；50 50 毫升毫升以上大容量液体采用薄膜过滤法检查首次收载全封闭无菌测试技术以上大容量液体采用薄膜过滤法检查首次收载全封闭无菌测试技术阳性阳性对照：金照：金葡、生葡、生孢、白念均、白念均1010 ～～100100个菌抑个菌抑细菌和抑真菌菌和抑真菌试验20052005年版年版增收隔离系统，环境洁净度的验证，培养基适用性检查，稀释液冲洗液品种；规定优增收隔离系统，环境洁净度的验证，培养基适用性检查，稀释液冲洗液品种；规定优先采用薄膜过滤法；检验方法的验证试验；延长培养时间为先采用薄膜过滤法；检验方法的验证试验；延长培养时间为1414天、取消复试。

天、取消复试20102010年版年版在在20052005版基础上强调检验的过程控制，保证检验结果的准确性版基础上强调检验的过程控制，保证检验结果的准确性我国药典无菌检查法的历史发展我国药典无菌检查法的历史发展 2005年版主要变化10000下局部100级，隔离系统， GB-洁净度验证培养基适用性检查方法验证试验优先用封闭式薄膜过滤器增加稀释液冲洗液品种直接接种法 “一对一” 延长培养时间为14天对表1 强调了“每种培养基最少检验数量”取消复试2010年版主要变化对无菌检查人员提出专业要求和培训增加了可选用其它经验证的稀释液、冲洗液方法验证试验菌：金、大、枯、生、白、黑冲洗量：少量（约100ml）多次，总量不超过1000ml强调检验的过程控制，保证检验结果的准确性我国药典无菌检查法的历史发展 我国药典无菌检查法与欧美药典的差异我国药典无菌检查法与欧美药典的差异比较项目比较项目ChP2010ChP2010USP35USP35EP7.0EP7.0检验条件条件规定定总体总体1000010000级、局部级、局部100100级级应在无菌条件下进行。

应在无菌条件下进行 应在无菌条件下进行应在无菌条件下进行人员要求人员要求具备微生物专业知识，并经过无具备微生物专业知识，并经过无菌技术的培训菌技术的培训 经培训和认可经培训和认可 经培训和认可经培训和认可 培养基、培养条培养基、培养条件与时间件与时间 硫乙醇酸盐流体培养基硫乙醇酸盐流体培养基3030～～3535℃℃；；2020～～25℃(25℃(三部）三部）改良马丁培养基改良马丁培养基 2323～～2828℃℃均均培养培养1414天天，，转种后细菌培养转种后细菌培养2 2天、真菌培天、真菌培养养3 3天天硫乙醇酸盐流体培养基硫乙醇酸盐流体培养基3030～～3535℃℃胰酪大豆胨液体培养基胰酪大豆胨液体培养基2020～～25℃25℃ 培养培养不少于不少于1414天天转种后培养不少于转种后培养不少于4 4天天硫乙醇酸盐流体培养基硫乙醇酸盐流体培养基3030～～3535℃℃胰酪大豆胨液体培养基胰酪大豆胨液体培养基 2020～～25℃25℃培养培养不少于不少于1414天天转种后培养不少于转种后培养不少于7 7天天培养基灵敏度培养基灵敏度检查与方法与方法验证用用菌株菌株金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌；金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌；生生孢梭菌；梭菌；白色念珠菌、白色念珠菌、黑曲霉黑曲霉检验方法方法只要供试品性状允许，应采用薄只要供试品性状允许，应采用薄膜过滤法膜过滤法性状允许的样品采用薄膜过滤，性状允许的样品采用薄膜过滤，利于抗菌影响去除利于抗菌影响去除采用薄膜过滤，利于抗菌影采用薄膜过滤，利于抗菌影响去除响去除稀稀释剂与薄膜与薄膜过滤冲洗液冲洗液1 1、、0.10.1％蛋白胨水溶液；％蛋白胨水溶液；2 2、、pH7.0pH7.0氯化钠氯化钠- -蛋白胨缓冲液蛋白胨缓冲液3 3、其他经验证过的溶液、其他经验证过的溶液1．．0.1%蛋白胨水溶液；蛋白胨水溶液；2．．0.1%蛋白胨水溶液＋蛋白胨水溶液＋1ml吐温吐温803．动物组织消化液＋牛肉浸．动物组织消化液＋牛肉浸膏＋吐温膏＋吐温801．．0.1％蛋白胨水溶液％蛋白胨水溶液2．．0.1％蛋白胨水溶液＋％蛋白胨水溶液＋0.1％（聚乙氧基乙醇、％（聚乙氧基乙醇、0.1％吐％吐温温-80））3．十四烷酸异丙酯。

．十四烷酸异丙酯 结果判断与复果判断与复试规定定一次检出结果为准一次检出结果为准 ( (设备及环境不符合要求、实验过程有可能引起污染的因素、阴性对照有菌生设备及环境不符合要求、实验过程有可能引起污染的因素、阴性对照有菌生长、分离微生物可明确归因于无菌实验过程中所用的材料或技术错误造成的单倍量重试长、分离微生物可明确归因于无菌实验过程中所用的材料或技术错误造成的单倍量重试) ) 2015版药典无菌检查法的增、修订内容 1、方法应用范围增加“生物制品” 2、实验环境的修订 3、培养基体系的修订 4、检查方法的整合修订 5、参照USP 对表2、表3的整合修订－－50100200不作规定不作规定不作规定不作规定290003520000D级级－－25501002900035200002900352000C级级555102900352000293520B级级< <1< <1< <1< <120 3520203520A级级5指手指手套套cfu /手手套套接触碟接触碟/（（f f55mm））cfu /≥5.0μm≥0.5μm≥5.0μm≥0.5μm表面微生物表面微生物沉降沉降菌菌（（f f90mm））cfu /4h(2)浮游浮游菌菌cfu/m3动态动态静态静态微生物监测的动态标准微生物监测的动态标准(1)悬浮粒子最大允许数悬浮粒子最大允许数/立方米立方米洁洁净净度度级级别别实验环境的重大修订 动态动态 2010年版无菌检查 应在洁净度10000级背景下的局部100级单向流空气区域内或隔离系统进行2015年版无菌检查在无菌条件下进行试验，环境必须达到无菌检查的要求。

无菌检查环境修订 2010年版 1.硫乙醇酸盐流体培养基 30～ 35 ℃； 20～25℃2.改良马丁培养基 23 ～ 28 ℃培养3. 选择性培养基 4. 0.5%葡萄糖肉汤培养基 5. 营养肉汤培养基6. 营养琼脂培养基 7. 改良马丁琼脂培养基2015年版1. 硫乙醇酸盐流体培养基 30～ 35 ℃； 20～25℃培养2. 胰酪大豆胨肉汤培养基 20 ～ 25℃培养 3. 选择性培养基 4. 0.5%葡萄糖肉汤培养基5. 胰酪大豆胨琼脂培养基 6. 沙氏葡萄糖肉汤培养基 7. 沙氏葡萄糖琼脂培养基 培养基增修订内容硫乙醇酸盐流体培养基 厌氧菌检查（首选） 需气菌检查胰酪大豆胨液体培养基 真菌和需气菌的检查 适用范围培养基灵敏度检查实验菌株的修订 2010年版 硫乙醇酸盐流体培养基金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌改良马丁培养基 白色念珠菌、黑曲霉 2015年版硫乙醇酸盐流体培养基金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌、胰酪大豆胨液体培养基 枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌液制备用培养基2010年版1、接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌新鲜培养物至营养肉汤培养基培养基2、接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基3、接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基4、接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上2015年版 1、接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基2、接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基3、接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖肉汤培养基 4、接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂培养基 2010版 硫乙醇酸盐流体培养基接入小于100 cfu的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌 改良马丁培养基接入小于100 cfu的白色念珠菌、黑曲霉。

2015版硫乙醇酸盐流体培养基接入小于100CFU的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、生孢梭菌各2管胰酪大豆胨液体培养基接入小于100CFU的枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉方法适用性试验的修订ICH Q6B， USP、EP、BP、JP无菌检查法中生物技术产品/及生物制品检定规程、标准没有对生物制品作出特殊的规定整合中的焦点：培养温度 三部无菌检查法规定样品接种硫乙醇酸盐流体培养基必须分成双份，分别置30～35℃、 20～25℃两个温度下培养以致在取样量、检验量、接种方式、培养温度、阳性对照试验等方面存在与二部不一致的规定 修订原则： 以国际发展趋势为主导，遵照2015年版药典编制大纲的要求进行，以二部为基础，整合稿保留了生物制品无菌检查法的特点，在检验数量、检验量、阳性对照、培养温度方面互相兼顾，作原则性要求而不作具体细则规定致力于逐步修订完善 检验数量的整合检验数量的整合 2010 2010版版检验数量检验数量 是指一次试验所用供试品最小包装容器的数量除另有规定外，出是指一次试验所用供试品最小包装容器的数量除另有规定外，出厂产品按表厂产品按表1 1规定；上市产品监督检验按表规定；上市产品监督检验按表2 2、表、表3 3规定。

表规定表1 1、表、表2 2、表、表3 3中中最少最少检验数量不包括阳性对照试验的供试品用量检验数量不包括阳性对照试验的供试品用量 一般情况下，供试品无菌检查若采用薄膜过滤法，应增加一般情况下，供试品无菌检查若采用薄膜过滤法，应增加1/21/2的最小检验数的最小检验数量作阳性对照用；若采用直接接种法，应增加每种培养基中所接种的量作阳性量作阳性对照用；若采用直接接种法，应增加每种培养基中所接种的量作阳性对照用 20152015版版检验数量是指一次试验所用供试品最小包装容器的数量除另有规定外，检验数量是指一次试验所用供试品最小包装容器的数量除另有规定外，①①出厂产品按表出厂产品按表1 1规定；规定；②②上市产品监督检验按表上市产品监督检验按表2 2规定规定表表1 1、表、表2 2中中最少检验数量不包括阳性对照试验的供试品用量最少检验数量不包括阳性对照试验的供试品用量检验量的整合检验量的整合 2010版版 2015版版 检验量：检验量： 是指一次试验所用的供试品总量是指一次试验所用的供试品总量（（g g或或mlml）。

除另有规定外，每份培）除另有规定外，每份培养基接种的供试品量按表养基接种的供试品量按表2 2、表、表3 3规定若每支（瓶）供试品的装量按规定足若每支（瓶）供试品的装量按规定足够接种两份培养基，则应分别接种硫够接种两份培养基，则应分别接种硫乙醇酸盐流体培养基和乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养改良马丁培养基采用薄膜过滤法时，检验量应不采用薄膜过滤法时，检验量应不少于直接接种法供试品的总接种量，少于直接接种法供试品的总接种量，只要供试品特性允许，应将所有容器只要供试品特性允许，应将所有容器内的全部内容物过滤内的全部内容物过滤 检验量检验量是指供试品每个最小包装接种至每份培养是指供试品每个最小包装接种至每份培养基的最小量（基的最小量（g g或或mlml）除另有规定外供试品检验按表除另有规定外供试品检验按表3 3规定若每规定若每支（瓶）供试品的装量按规定足够接种两支（瓶）供试品的装量按规定足够接种两种培养基，则应分别接种硫乙醇酸盐流体种培养基，则应分别接种硫乙醇酸盐流体培养基培养基和胰酪大豆胨液体培养基和胰酪大豆胨液体培养基采用薄膜过滤法时，只要供试品特性允许，采用薄膜过滤法时，只要供试品特性允许，应将所有容器内的全部内容物过滤。

应将所有容器内的全部内容物过滤 检验量的整合检验量的整合 2010版版 检验量是指一次试验所用的供试品总量（检验量是指一次试验所用的供试品总量（g g或或mlml）除另有规定外，每份培养基）除另有规定外，每份培养基接种的供试品量按表接种的供试品量按表2 2、表、表3 3规定若每支（瓶）供试品的装量按规定足够接种两规定若每支（瓶）供试品的装量按规定足够接种两份培养基，则应分别接种硫乙醇酸盐流体培养基和份培养基，则应分别接种硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基改良马丁培养基采用薄膜过采用薄膜过滤法时，检验量应不少于直接接种法供试品的总接种量，只要供试品特性允许，滤法时，检验量应不少于直接接种法供试品的总接种量，只要供试品特性允许，应将所有容器内的全部内容物过滤应将所有容器内的全部内容物过滤 2015版版 检验量是指供试品每个最小包装接种至每份培养基的最小量（检验量是指供试品每个最小包装接种至每份培养基的最小量（g g或或mlml）除另有规定外供试品检验按表除另有规定外供试品检验按表3 3规定若每支（瓶）供试品的装量按规定足够接规定若每支（瓶）供试品的装量按规定足够接种两种培养基，则应分别接种硫乙醇酸盐流体培养基种两种培养基，则应分别接种硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基。

和胰酪大豆胨液体培养基采用薄膜过滤法时，只要供试品特性允许，应将所有容器内的全部内容物过滤采用薄膜过滤法时，只要供试品特性允许，应将所有容器内的全部内容物过滤  参照参照USP USP 对表对表1 1、表、表2 2、表、表3 3整合修订内容整合修订内容2010版表1. 批出厂产品最少检验数量 表2. 液体制剂最少检验量及上市抽验样品的最少检验数量表3. 固体制剂最少检验及上市抽验样品的最少检验数量2015版表1.批出厂产品及生物制品的原液和半成品最少检验数量注 若供试品每个容器内的装量不够接种两种培养基，那么表中的最少检验数量加倍表2. 上市抽验样品的最少检验数量 （包括液体和固体制剂）注 ①若供试品每个容器内的装量不够接种两种培养基，那么表中的最少检验数量加倍 ②抗生素粉针剂（≥5g) 及抗生素原料药的最少检验数量为6瓶（或支） 筒装固体原料的最少检验数量为4个包装根据具体情况定表3. 供试品的最少检验量（包括液体和固体制剂）注 如果医疗器械体积过大，培养基用量可在2000 ml以上，将其完全浸没 阳性对照试验 按原二部的规定： ⒈供试品用量同供试品无菌检查每份培养基接种的样品量。

⒉阳性对照试验的菌液制备同方法适用性试验，加菌量小 于100CFU ⒊阳性对照管培养48～72小时应生长良好 阴性对照试验 阴性对照试验 按原二部的规定： 取相应溶剂和稀释液、冲洗液同法操作，作为阴性对照 阴性对照不得有菌生长薄膜过滤法 2010版 薄膜过滤法应优先采用封闭式薄膜过滤器，也可使用一般薄膜过滤器水溶液供试品 ： 取规定量，直接过滤，或混合至适量含适宜稀释液的无菌容器中，混匀，立即过滤如供试品具有抑菌作用，须用冲洗液冲洗滤膜，冲洗次数一般不少于三次，所用的冲洗量、冲洗方法同方法适用性试验 2015版 薄膜过滤法应采用封闭式薄膜过滤器水溶液供试品 ：增加：①一般样品冲洗后，1份滤器加入100ml硫乙醇酸盐流体培养基，1份滤器加入100ml胰酪大豆胨液体培养基 ② 生物制品样品冲洗后，2份滤器加入100ml硫乙醇酸盐流体培养基，1份滤器加入100ml胰酪大豆胨液体培养基直接接种法2010版直接接种法取规定量供试品分别等量接种至硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基中。

2015版增订：①直接接种法适用于无法用薄膜过滤法进行无菌检查的供试品，即取规定量供试品等量接种于硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨肉汤培养基中除生物制品外，一般样品两种培养基接种的支/瓶数相等；②生物制品硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基接种的支/瓶数为2：1 培养及观察整合 2010版将上述接种供试品后的培养基容器分别按各培养基规定的温度培养14天；外观上判断不能从有无微生物生长，可取该培养液适量转种至同种新鲜培养基中，细菌培养2天、真菌培养3天2015版将上述接种供试品后的培养基容器分别按各培养基规定的温度培养14天；增订：接种生物制品供试品的硫乙醇酸盐流体培养基的容器应分成两等份，一份置30～35℃培养，一份置20～25℃培养 修订：不能从外观上判断有无微生物生长，可取该培养液适量转种至同种新鲜培养基中，培养3天 结果判断整合按原二部的规定 2015版无菌检查法增、修订内容说明1.无菌检查法收载于《中国药典》三部通则中，一部和二部内容一致2.以2010年版二部的“无菌检查法”为基础进行整合和修订3. 保留了生物制品的特点如检查数量、硫乙醇酸盐流体培养基接种份数和培养温度等。

4.在无菌条件下进行试验，环境必须达到无菌检查的要求5.改良马丁培养基修订为胰酪大豆胨液体培养基6.方法验证试验修订为方法适用性试验7.由于培养基的改变，培养基的灵敏度和方法适用性试验也做了修订8.修订了表一、表二、表三的内容  2010版 金葡、大肠、枯草、生孢 白色、黑曲2015版金葡、大肠、生孢枯草、白色、黑曲方法适用性试验的菌株 ⒈医院制剂当前面临的形势 ⒉医院制剂微生物检查重点 ⒊个例医院制剂进行微生物控制的必要性医院制剂当前面临的形势⒈贯彻《国家药品安全“十二五”规划》，加强对医疗机构制剂监督管理⒉统一标准、提高标准，完成质量标准修订工作，保证制剂质量⒊高风险制剂制定科学、合理的质量标准和技术规范，确保安全、有效和质量可控⒋淘汰市场巳有供应或疗效不确等不符合国家注册要求的品种⒌医院制剂微生物检查的现状医院制剂微生物检查的现状⒈领导班子有待重视⒉微生物检验人员缺乏，技术力量薄弱⒊基本的仪器设备空缺⒋操作不规范，标准掌握不透⒌部分单位没有正常开展微生物检验工作 医院制剂微生物检查重点妇科、儿科及风险高、质量可控不强的冲洗剂、眼用制剂及用于烧伤、创伤等需要进行无菌检查严格的制定质量标准。

微生物检查应对其方法可行性，可靠性进行验证（适用性检查），以保证检验方法的科学性，检验结果的准确性⒈国家规定 滴眼液应进行无菌检查①2010版《中国药典》制剂通则规定眼用制剂照无菌检查法检查,应符合规定② 国家局（2010）43号文“关于实施《中国药典》2010年版有关事宜的公告”－ 五、中国药典关于眼用制剂无菌要求的具体执行时间将根据《药品生产质量管理规范》实施的要求另行规定③国家局（2012）106号文，眼内注射液，眼内插入剂，供手术、伤口、角膜穿透伤用的眼用制剂以及眼用液体制剂应在2013年12月31日前达到新修订药品GMP要求，其它眼用制剂应在2015年12月31号前达到新修订药品GMP要求滴眼液无菌检查－薄膜过滤法进行方法适用性试验保证采用正确的检验方法对每株试验菌逐一进行验证检验方法 现行中国药典培养基与试验菌株同微生物计数方法 检验方法滴眼液无菌检查－薄膜过滤法方法适用性试验取样量批产量＞200支，每种培养基最少检验数量10支，装量 5ml~8 ml, 够接种两种培养基，加上阳性用量共15支（瓶）全量过膜，每膜5瓶，每菌5瓶过膜，冲洗，每膜100ml /次，总量不超过1000 ml 。

最后一次的冲洗液加＜100cfu 试验菌，接种相应培养基另取同体积培养基罐，加＜100cfu试验菌作阳性各试验菌同法操作分别置规定温度培养 3～5天分别加＜ 100cfu 各菌5支5支5支5支5支5支黑白生枯金大硫盐硫盐 TSB 大金生枯白黑硫盐硫盐 TSB 分别加＜ 100cfu 各菌对照管比较对照管比较 置规定温度培养 3～5天方法适用性试验－滴眼液薄膜过滤法0冲洗（无抑菌）试试验验组组对对照照组组38 以上有不当之以上有不当之处，，请大家大家给与批与批评指指正，正，谢谢大家！大家！。