医学复习资料：生化实验汇总.docx

手工法1.血清总蛋白（Total protein,TP）——（双缩脲法）分子中含有两个或两个以上甲酰胺基（—CONH2—）的化合物都能和碱性铜溶液作用，形成紫色复合物，这种反应称双缩脲反应蛋白分子中含有许多肽键(—CONH—)，都能发生双缩脲反应，而且各种血浆蛋白质成色程度基本相同因此在一定浓度范围内与肽键数量及蛋白质含量成正比，经与同样处理的蛋白质标准液比较，即可求得蛋白质含量双缩脲反应式如下：实验试剂：6mol/L NaOH溶液、双缩脲试剂、双缩脲试剂空白试剂、60-70g/L蛋白质标准液实验仪器：722分光光度计步骤：（1）按下表加入试剂（S：R＝1：80）血清总蛋白测定加入物（ml）空白管（B）标准管（S）测定管（U）血清——0.04蛋白质标准液—0.04—蒸馏水0.04——双缩脲试剂3.23.23.2（2）37C水浴10min，在波长=540nm比色，以空白管调零，读取各管A值进行计算3）结果计算血清总蛋白（g/L）=（测定管（或校正）吸光度/标准管吸光度）*蛋白标准液浓度（g/L）参考区间：60-80g/L2.血清蛋白（Albumin,A）——(溴甲酚绿法)血清蛋白在PH4.1环境中带正电荷，在非离子去垢剂聚氧化乙烯月桂醚存在时，与带电的染料溴甲酚绿（ＢＣＧ）结合形成蓝绿色化合物。

在630nm有吸收峰，颜色深浅与清蛋白浓度成正比，与同样处理的清蛋白标准比较，可求得血清中白蛋白含量，反应式如下： 实验试剂：BCG试剂（琥珀酸缓冲液（PH 4.2）、溴甲酚绿、聚氧乙烯月桂醚）、白蛋白标准液（40g/L）实验仪器：722分光光度计步骤：（1）按上表加入试剂（S：R=1:300）（2）混匀，室温放置30秒，波长630nm，用空白管调零，读取各管A值3)结果计算血清蛋白（g/L）=（测定管吸光度/标准管吸光度）*标准清蛋白浓度（g/L）参考区间：40-55g/L注意事项:1..BCG是一种PH指示剂，变色域为PH3.8（黄色）-5.4（蓝绿色），控制PH是关键！3.尿酸的检测原理（终点法） 546nm波长处检测吸光度，颜色深浅与尿酸的量成正比试剂：R1（粉）：尿酸酶、 POD、 4-AAP、TOOS R2（液）：磷酸盐缓冲液 R1+R2=R 尿酸标准液（301μmol/L）S：R=1:50 3ml体系 检测血清步骤：混匀，37℃保温10 min，以空白管校零后，在546nm波长下读取标准管及样本管吸光度A标、A测健康成年男性：202-416μmol/L健康成年女性：142-339μmol/L4.尿素的检测原理（两点法）脲酶尿素+H2O 2NH3+CO2 GLDHNH3 +α-酮戊二酸+NADH+H+ 谷氨酸+NAD++ H2O340nm波长下吸光度下降的速率与尿素的量成正比实验试剂：R1（粉）： 脲酶、谷氨酸脱氢酶、NADH R2（液）：缓冲液、α-酮戊二酸 R1+R2=R 尿素标准液（ 7.1mmol/L ）S：R=1:100(1ml体系) 检测血清步骤：空白管标准管待测管蒸馏水3ml标准品30ul待测血清30ul工作液3ml3ml反应30秒和60秒两点检测吸光度，波长=340nm参考区间： 2.9 - 8.2 mmol/L注意事项：1、先准备好试剂，一加样立即混匀并检测2 、防止氨离子的污染3、血氨升高可使尿素测定结果偏高，两点速率法能较好地消除内源性氨的干扰4、用蒸馏水空白调零即可5.肌酐的检测原理（两点法）肌酐+碱性苦味酸 → 橘红色的苦味酸肌酐复合物505nm波长下处检测吸光度，颜色深浅与肌酐的量成正比试剂：R1（液）：氢氧化钠 R2（液）：苦味酸 R1+R2（1:1）=R 肌酐标准液（133μmol/L ）S:R=1:10（3ml体系） 检测血清仪器：722分光光度计 半自动生化分析仪空白管标准管待测管蒸馏水300ul标准品300ul待测血清300ul工作液3ml3ml3ml波长=505nm（注意：一定要混匀后立即上机检测）参考区间：男性62-115 μmol/，L女性53-97μmol /L注意事项：1、标本即加即检2 、不宜使用全血标本，全血中假肌酐物质较多3 、需进行试剂空白调零6.甘油三酯测定的原理（酶法）:试剂：R1(液)(Tris缓冲液（PH 7.6）、4－氯酚)R2(粉)(ATP，4-AAP，LPL，GPO，GK ， POD)甘油三酯标准液(2.26mmol/L)步骤：1. 样品与试剂按1:100比例混匀，其中试剂为3ml，设置空白管、标准管与待测管；2. 放置于37℃水浴箱中水浴10min；用722分光光度计测量每支管的吸光度（波长=505nm）TG测定加入物（ml）测定管（U）标准管（S）空白管（B）R333标准液-0.03-待测液0.03--参考区间[0.55～1.70]7.总胆固醇测定原理（酶法）试剂：R1(粉)(CHE、CHOD、POD)R2(液)(磷酸缓冲液(PH7.7) 、4-AA、酚)　总胆固醇标准液(4.85mmol/L)1.样品与试剂按1:100比例混匀，其中试剂为3ml，设置空白管、标准管与待测管；2.放置于37℃水浴箱中水浴10min；3.用722分光光度计测量每支管的吸光度（波长=505nm）CH测定加入物（ml）测定管（U）标准管（S）空白管（B）R333标准液-0.03-待测液0.03--参考区间[3.0,5.18]TG和CH注意事项：1.饮食的影响。

2. Trinder反应的干扰还原性物质干扰）8.血清总钙的测定邻甲酚酞络合酮法在pH 11的碱性溶液中，邻-甲酚酞络合酮(OCPC)与钙络合生成紫红色螯合物，此紫红色螯合物在575nm波长处有吸收峰，与同样处理的钙标准液比较，利用比尔定律进行计算，以求得血清总钙的含量试剂：待测血清标本、蒸馏水（最好用去离子水或重蒸馏水）、R1：乙醇胺缓冲、R2：8-羟基喹啉、邻-甲酚酞络合酮（OCPC）、血清钙标准液（2.34mmol/L）R1：R2＝1：1混合成应用液R实验仪器：半自动生化分析仪1.按S:R=1:50配3ml体系血清总钙测定加入物（ml）空白管（B）标准管（S）测定管（U）R333蒸馏水0.06--钙标准液-0.06-待测血清--0.062.37℃水浴5分钟3.722分光光度计，波长=575nm参考区间：成年人：2.03~2.54mmol/L注意事项：1.外源性Ca2+污染2.标本最好用血清或肝素抗凝的血浆3.镁对钙测定的干扰方法学评价9. 批内重复性试验批内重复性试验是指在相同条件下(用同样的方法，同一种试剂和标准品，同一台仪器，在同一实验室由同一人操作)对同一标本在尽可能短的时间内进行多次分析测定，以获得批内精密度数据的试验方法。

其结果能反映各次测定结果相互接近的程度，用于客观评价GOD-POD法测血糖随机误差的大小配制试剂：R1+R2混匀即可按下表加入试剂，其中测定管按照5轮，每轮4次进行血糖测定，即可获得20个测定数据各管混匀后，37°C水浴10min，在505nm波长下进行比色利用722分光光度计测量每支管的吸光度，利用已知标准管GLU浓度为5.55mmol/L，然后根据A=KbC，浓度与吸光度成正比，通过公式Glu（mmol/L）=测定管A\标准管A*5.55，来计算血清血糖浓度注意事项：为了缩小测定值的离散程度，操作中必须准确加入标准液及标本量，并严格控制反应时间，准确读数比色杯成套性实验：用蒸馏水测，选用波长（420nm—440nm），透光率相差在0．5%以内为合格 ）10.回收实验：1.回收试验主要是用来分析某临床检测方法正确测定加入常规分析样品的纯分析物的能力，目的是测定比例系统误差，以此来评价候选方法的准确度血清标本、葡萄糖标准(80mmol/L)、蒸馏水、质控品1和2GOD-POD试剂（A、B液）、Glu标液：5.55mmol/L步骤：1. 样品制备基础样品血清0.9ml + 0.1ml蒸馏水回收样品Ⅰ血清0.9ml＋0.01ml 80mmol/L葡萄糖标准液＋0.09ml蒸馏水回收样品Ⅱ血清0.9ml＋0.06ml 80mmol/L葡萄糖标准液＋0.04ml蒸馏水回收样品Ⅲ血清0.9ml＋0.09ml 80mmol/L葡萄糖标准液＋0.01ml蒸馏水2. 血糖浓度测定按GOD-POD法测定各制备样品的血糖浓度，每份样品作2次检测，结果取平均值。

3. 加入浓度计算（理论真实值）加入浓度(mmol/L)=标准液浓度×标准液量（ml）血清量ml+标准液量ml+蒸馏水（ml）回收量计算（实际测得值）回收量＝回收样品测得值－基础样品测得值回收率计算：回收率(%)=×10011.干扰实验：本实验选用VitC做GOD-POD法测血糖的干扰试验 1.维生素C具有还原性，可与GOD反应生成的H2O2发生反应，干扰H2O2参加第二步POD的偶联反应，从而降低显色强度，使检测结果偏低 因此， VitC对该反应有干扰，但不是VitC被测定 2.干扰试验可反映分析物以外其他物质对分析方法对分析物测定准确度的影响以评价分析方法的准确性干扰物浓度一定时，产生的误差是恒定系统误差试剂：1.血清标本、VitC（15mmol/L）、蒸馏水2.室内质控：测定1号和2号2个质控品3.室间质评：测定5个具有靶值的血清样品4.GOD-POD试剂（A、B液）5.Glu标液：5.55mmol/L 1. 室内质控：按GOD-POD法分别测定1号和2号2个质控品（实验前测一次、实验中测一次），同时测定标准管以及空白管2. 室间质评：按GOD-POD法分别测定5个具有靶值的血清样品3. 样品制备4. GOD-POD法测血糖 （测两次求平均值）按GOD-POD法分别测定4个制备样品的血糖浓度。

各管混匀后，37°C水浴10min，在512nm（校正值）波长下进行比色利用722分光光度计测量每支管的吸光度，利用已知标准管GLU浓度为5.55mmol/L，然后根据A=KbC，浓度与吸光度成正比，通过公式Glu（mmol/L）=测定管A/标准管A*5.55，来计算血清血糖浓度5. 计算：1) 干扰物加入值计算（终浓度）干扰物加入浓度(mg/L)=干扰物浓度× 干扰物溶液量（ml）血清量ml+干扰溶液量ml+蒸馏水量（ml）2） 干扰值计算（偏差）干扰值（mmol/L）。