《酶工程实验》word版.doc

实验一 过氧化氢酶米氏常数的测定一、 目的了解米氏常数的意义，测定过氧化氢酶的米氏常数二、 实验原理 H2O2被过氧化氢酶分解出H2O和O2，未分解的H2O2用KMNO4在酸性环境中滴定，根据反应前后H2O2的浓度差可求出反应速度本实验以马铃薯提供过氧化氢酶，以1/ν~1/[S]作图求Km三、 实验器材1. 锥形瓶100～150ml（×6）2. 吸管1.0ml（×2）、0.5ml（×2）、2.0ml（×2）、5ml（×2）、10.0ml（×1）3. 温度计（0～100℃）4. 微量滴定管5ml（×1）5. 容量瓶1000ml（×1）四、 实验试剂1、0.02mol/L磷酸缓冲液（Ph7.0） 取磷酸二氢钾 0.68g，加0.1mol/L氢氧化钠溶液 29.1ml，用水稀释至100ml,即得2、酶液：称取马铃薯5g，加上述缓冲液10ml，匀浆，过滤3、0.02mol/L KMnO4 ：称取KMnO4（AR）3.2g，加蒸馏水1000ml，煮沸15min，2d后过滤，棕色瓶保存4、0.004mol/L KMnO4 ：准确称取恒重草酸钠0.2g，加250ml冷沸水及10ml浓硫酸，搅拌溶解，用0.02ml/L的KMnO4滴定至微红色，水浴，加热至65℃，继续滴定至溶液微红色并30s不褪，算出KMnO4的准确浓度稀释成0.004mol/L即可。

5、0.05 mol/L H2O2：取30% H2O2 23ml加入1000ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度（约0.2mol/L），用标准KMnO4（0.004mol/L）标定其准确浓度，稀释成0.05mol/L（标定前稀释4倍，取2.0ml，加25% H2SO42.0ml，用0.004mol/L KMnO4滴定至微红色）6、25% H2SO4五、操作 取锥形瓶6只，按下表顺序加入试剂：表一 过氧化氢酶米氏常数的测定 管号试剂0123450.05mol/L H2O2/ml蒸馏水/ml酶液/ml09.50.51.008.500.51.258.250.51.677.830.52.57.00.55.004.500.5先加好0.05mol/L H2O2及蒸馏水，加酶液后立即混合，依次记录各瓶的起始反应时间各瓶时间达5min时立即加2.0ml 25%硫酸终止反应，充分混匀用0.004mol/L KMnO4滴定各瓶中剩余的H2O2至微红色，记录消耗的KMnO4体积六、计算分别求出各瓶的底物浓度[S]和反应速度v[S]=c1V1/10 式中[S]：底物物质的量浓度（mol/L）； c1：H2O2物质的量浓度（mol/L）；V1：H2O2体积（ml）；10：反应的总体积（ml）；υ：反应速度（m mol/min）；c2：KMnO4物质的量浓度（mol/L）；V2：KMnO4体积（ml）；以1/υ对1/[S]作图求出Km。

实验二 酶促反应中初速度时间范围测定一、实验目的1.了解酶促反应中初速度时间范围测定的基本原理；2.掌握酶促反应中初速度时间范围的测定方法二、实验原理酸性磷酸酯酶（acid phosphatase, EC 3.1.3.2）广泛分布于动植物体中，尤其是植物的种子、动物肝脏和人体的前列腺中它对生物体内核苷酸、磷蛋白和磷脂的代谢起着重要作用酸性磷酸酯酶能专一性水解磷酸单酯键以人工合成的对硝基苯磷酸酯（4-nitrophenyl phosphate, NPP）作底物，水解产生对硝基苯酚和磷酸在碱性溶液中，对硝基酚的盐离子于405nm处光吸收强烈，而底物没有这种特性利用产物的这种特性，可以定量的测定产物的生成量，从而求得酶的活力单位即通过测定单位时间内405nm处光吸收值的变化来确定酸性磷酸酯酶的活性酸性磷酸酯酶的一个活力单位是指在酶反应的最适条件下，每分钟生成1μmol产物所需的酶量要进行酶活力测定，首先要确定酶反应时间而酶的反应时间应该在初速度时间范围内选择可以通过进程曲线的制作来求出酶的初速度时间范围进程曲线的制作是指在酶反应的最适条件下，采用每隔一定时间测定产物生成量，以酶反应时间为横坐标，产物生成量为纵坐标绘制而成。

从进程曲线可知，在曲线起始的一段时间内为直线，其斜率代表初速度随着反应时间的延长，曲线趋于平坦，斜率变小，反应速度下降要真实反映出酶活力大小，就应在初速度时间内测定三、实验试剂与器材1.试剂（1）酸性磷酸酯酶原液（从绿豆芽中提取）（2）酸性磷酸酯酶液（通过原酶液稀释得到） 取原酶液，用0.05mol/L、pH5.0柠檬酸盐缓冲液稀释，使进程曲线中第11号管吸光度A405在0.6～0.7之间3）1.2mmol/L对硝基苯磷酸酯精确称取NPP0.4454g，加缓冲液定容至100mL4）0.3mol/LNaOH溶液2．器材恒温水浴槽，可见分光光度计，试管，刻度吸管，离心机四、操作步骤1.酸性磷酸酯酶原酶液的制备称取一定重量的绿豆，浸泡24h，在25～30°C温箱中培养5～7d长出的豆芽取其颈部，依次用自来水和重蒸水冲洗干净，置滤纸上吸干水分，称30g 放入研钵中匀浆，加0.2mol/L乙酸盐缓冲液4mL，置4°C冰箱中6h以上然后用双层纱布挤压过滤，滤液6000r/min离心15min,上清液置透析袋用蒸馏水充分透析，间隔换水10次，透析24h以上将透析后酶液稀释至最终体积与豆芽质量（g）相等，以6000r/min离心30min，所得上清液即为原酶液，置冰箱待用。

2.酶促反应取试管12支，按表1.1编号，0号为空白各管加入1.0mL1.2mol/LNPP；另外2支试管，各加入稀释好的酶液7mL，在酶反应前底物与酶都放入35°C恒温水浴槽中预热2min然后向1～11号管内各加入1.0mL预热的酶液立即摇匀并开始计时按时间间隔为3min、5min、7min、10min、12min、15min、20min、25min、30min、40min、50min进行反应待反应进行到上述各相应时间时，加入3.0mL 0.3mol/L NaOH终止反应冷却后以0号管作空白（0号管加入1.0mL NPP后保温25min，然后加入3.0mL 0.3mol/L NaOH，再加入1.0mL酶液），在分光光度计上测定各管A405值3.数据处理以反应时间为横坐标，A405值为纵坐标绘制进程曲线由进程曲线中直线部分求出酸性磷酸酯酶反应初速度的时间范围表1.1 制作酶促反应进程曲线时各物质加入量试管号12345678910110NPP（mL）稀释酶液(mL)反应时间（min）0．3M NaOH(mL)1.01.033.01.01.053.01.01.073.01.01.0103.01.01.0123.01.01.0153.01.01.0203.01.01.0253.01.01.0303.01.01.0403.01.01.0503.01.01.0253.0五、实验报告绘出酶促反应进程曲线，记录实验结果，计算酸性磷酸酯酶反应初速度的时间范围。

实验三 酵母蔗糖酶的部分纯化与酶活测定一、 目的：了解酶的纯化方法二、 原理：酵母中含有丰富的蔗糖酶(EC.3.2.1.26)，本实验以酵母为原料，通过破碎细胞方式得到粗酶，并用热变性法除杂蛋白纯化请参考相关教材）三、 试剂与仪器1、试剂与材料：(1) 干酵母(2) 石英砂(3) 1 mol/L醋酸溶液(4) 2 mol/L氢氧化钠溶液(5) 醋酸缓冲液（pH 4.6）(6) 5% 蔗糖溶液(7) DNS（3,5-二硝基水杨酸）试剂2、仪器：电子天平、离心机、分光光度计、水浴锅、电炉、研钵、试管、三角瓶、量筒、移液管四、 操作方法1、 破碎细胞取2 g干酵母于研钵中，加入2 g石英砂，加30 ml去离子水，研磨15 min，放入冰箱冷冻室（-20℃）冰冻约20 min（研磨液面上刚出现冰结为宜）取出冷冻酵母，再研磨5 min后，在5000 r/min条件下离心12 min，小心取出上清液（组分一）并量出体积V1，分别取0.5 ml上清液到试管A、B中，余者倒入三角瓶2、 纯化把三角瓶中的上清液用1 mol/L醋酸溶液调pH 5.0（试纸）然后迅速放入到55 ℃的水浴中，保温30 min。

之后在冰浴中迅速冷却在5000 r/min条件下离心12 min取出上清液（组分二）并量出体积V2，分别取0.5 ml上清液到试管C、D中3、 酶反应取四支试管，分别按顺序加入反应物：试管编号①酶液②氢氧化钠溶液③醋酸缓冲液④蔗糖溶液A（对照管）0.5 ml1 ml1 ml1 mlB0.5 ml---2 ml1 mlC（对照管）0.5 ml1 ml1 ml1 mlD0.5 ml---2 ml1 ml试管中反应物在55 ℃水浴中反应5 min（秒表计时）后，B、D管立即各加入1 ml氢氧化钠溶液（2 mol/L）终止反应，A、C管中各加入1 ml蒸馏水4、酶催化产物检测 取5支试管，分别加入反应物：试管编号反应液DNS试剂10.5 ml A0.5 ml20.5 ml B0.5 ml30.5 ml C0.5 ml40.5 ml D0.5 ml5（空白）0.5 ml 蒸馏水0.5 ml试管中反应物在沸水浴中反应5 min，然后冷却加入4 ml蒸馏水将各试管摇匀，用空白管溶液（5号管）调零点，测定它们的吸光度值A540五、 结果计算1、 酶活力单位的定义：本实验中，蔗糖酶的活力单位指在55℃条件下，每1 min催化底物转化为1 mg还原糖的酶量。

2、 酶活计算：粗酶的计算酶活（组分一）：纯化后酶的计算酶活（组分二）：3、 总酶活的计算：总酶活1（组分一，粗酶）：计算酶活×稀释倍数总酶活2（组分二，纯化后酶）：计算酶活×稀释倍数4、 酶活回收率的计算：酶活回收率 = 附：还原糖和总糖的测定——3,5-二硝基水杨酸比色法还原糖的测定是糖定量测定的基本方法还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计）还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540nm波长下测定光密度值，查。