分解纤维素霉菌的分离,纯化与鉴定.docx

分解纤维素霉菌的分离, 纯化与鉴定: Two strains of fungi decomposing cellulose were isolated from the soil of our campustaking the filter paper cellulose as carbon resource.For these strains,the experiments of decomposition of filter paper,determinations of CMC enzyme activity,FPA and natural cellulase activity were done.The results showed that:(1)It was the faster that the filter paper was decomposed by one black strain,and the filter paper was changed into paste during less than for 12 h.(2)CM C enzyme activity,FPA and natural cellulose activity of the strain were highest in five strains,reached 2.884(mg/mL)?30 min,0.36(mg/mL)?hand 2768(mg/mL)?d,respectively.0 引言纤维素是所有植物的主要组分,构成了植物干物质的1/3〜 2/3,世界上纤维素的年产量估计可达4X1010t(PierreBeguine,1990), 因而 , 纤维素是世界上最丰富而又不断新生的资源。

有取之不尽, 用之不竭的特点 然而 , 这种资源的大部分现在是作为废物而被抛弃掉在自然界中 , 这些“废物”是通过纤维素分解菌 , 即能产生纤维素酶的微生物将其自然分解的在我国纤维素资源极为丰富,每年仅农作物秸秆产量就高达7.0 x 108t,约相当于我国北方草原年打草量的 50 多倍 , 绝大部分地分没有得到充分利用在农村, 秸秆主要用作燃料、畜禽饮料与积肥,不仅利用率低, 还对环境造成污染[1] 因此 , 合理开发和科学利用农作物秸秆这一丰富的可再生资源是各国政府及广大科技工作者十分关注的问题但是纤维素很难被分解利用 , 如何将纤维素转化为能直接利用的资源和能源是摆在人们面前的一个难题利用微生物产生的纤维素酶将其转化为人类所需的能源、 食品和化工原料具有重要的现实意义近年来, 对秸秆类纤维素物质的利用主要采用生物法, 既利用微生物将纤维素、半纤维素降解并转化为菌体蛋白的方法因此, 分离和筛选高酶活的菌种显得尤为重要本研究在广泛搜集试材的基础上 , 分离筛选到一株酶活力高的纤维素分解菌1 材料和方法1.1 样品来源样品分别为富含纤维素分解菌的玉米地土壤、牛粪和酒糟1.2 培养基①分离平板培养基; ②液体培养基。

1.3 滤纸纤维素的制备将滤纸剪成1cm宽,6cm长的滤纸条1.4 菌株的分离、 纯化采用稀释涂布平板法进行菌种的分离和纯化1.5 菌落的观察和菌的鉴定对细菌进行革兰氏染色, 显微镜观察培养不同时间的细菌形态 将纯化培养的细菌分别接种于葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、棉子糖、木糖、阿拉伯糖, 并进行明胶液化、淀粉水解、V-P测定、呷噪试验、H2O2酶试验、硝酸盐的微量发酯管，37 C培养24—48h后观察结果根据《伯杰氏系统细菌学鉴定手册》进行鉴定1.6 酶活力测定1.6.1 标准曲线的绘制本研究采用 3,5- 二硝基水杨酸比色定糖法(DNS)测定酶解液中还原糖含量,取9支比色管,分别按表1 顺序加入各种试剂 , 将各管溶液混匀后 , 在 721 分光光度计上(520 nm) 进行比色测定, 用空白管溶液调零后 , 测定各管光密度值 . 以葡萄糖浓度为横坐标, 光密度值为纵坐标, 得标准曲线( 图1)1.6.2 滤纸分解度的观察在试管中加入酶液8 mL,再加入pH4.4柠檬酸缓冲液2 mL,摇匀后加入滤纸条(1cmX6cm)和几滴二甲苯 , 置于 50℃恒温水浴中静置反应24 h 后稍加震动, 观察其酶活力的分解强度:(+) 滤纸边缘膨胀;(++) 滤纸整齐膨胀并下弯;(+++) 滤纸不定形;(++++) 滤纸全成糊状. 若滤纸不到 24 h 全部分解 , 则记下达到全部被分解的时间 .1.6.3 CMC 酶活力测定移取酶液0.5 mL 于试管中 , 加入含质量浓度为0.5g CMC-Na的柠檬酸缓冲液(pH 4.4、0.05 mol/L)1.5mL,然后在50c水浴锅71确作用30 min后，立即按DNS&测定糖。

酶活力计算公式 :=[(mg/mL)?30min]式中 : 葡萄糖量―― 从标准曲线上查得的葡萄糖值(rag)1.6.4 滤纸糖化力测定移取稀释酶液4mL于试管中，加入柠 檬酸 (0.1 mol/L) 一磷酸氢二钠 (0.2 mol/L) 缓冲液 (pH 4.8)1 mL, 然后加入一张(1cmx 3 cm)滤纸,放入50c水浴锅71确作用1h后， 立即用DN效测定糖酶活力计算公式 :=(mg/mL)?h式中 : 葡萄糖量―― 从标准曲线上查得的葡萄糖值(rag) n酶液稀释倍数1.6.5 天然纤维素酶活力测定称取 1g秸秆纤维素置于50 mL带塞的三角瓶中 , 加入稀释酶液8mL,pH4.85、 0.1mol/L 柠檬酸缓冲液3mL,蒸储水4mL,摇匀,50 C水浴锅中酶解24h,过滤,按DNS 法测定还原糖酶活力计算公式 :=(mg/mL)?d式中 : 葡萄糖量――从标准曲线上查得的葡萄糖值(mg),n ―― 酶液稀释倍数2 实验结果2.1 菌落观察在配制好分离培养基后 , 把所需培养基和其他物品进行灭菌灭菌后 , 把培养基倒平再在平皿上接种以准备好的菌种 ( 泥土稀释液) 在 37 度下恒温培养, 培养两天后 , 在培养基上长有两种优势菌。

其它的都不长或只长一点 这两种优势菌一种为黑色, 一种为青色且都长在滤纸上或滤纸旁所以可初步断定为纤维素分解菌把上述两种菌在高倍镜下观察, 清晰可见许多孢子, 还可见许多扫帚状孢子丝, 形状与青霉菌相似 故亦可断定为霉菌培养基上的菌再经过两天的培养, 在滤纸上或旁长有另一些菌, 且一种白色絮状菌为主这种菌覆盖在上述两种优势菌上分析原因 : 上述两种纤维素分解菌在生长时可以利用滤纸做为碳源, 所以可以生长而其它的功败垂成不能分解滤纸做为碳源故不能生长经过几天的培养, 上述两种纤维素分解菌把多糖形式的纤维素分解成单糖 其它的菌在这种环境下就可以利用纤维素分解菌分解成的单糖而生长, 所以出现上述情况为得到上述两种纤维素分解菌的纯种须对其进行分离纯化仍配制和分离培养基成分一样的培养基对上述两种纤维素分解菌进行二次培养配制好后培养基进行灭菌, 单独对每种菌分别接种三个平皿,37 度恒温下培养2-3 天分别对每种根据真菌鉴定手册进行鉴定 根据手册鉴定, 上述两种菌黑色的是黑曲霉, 青色的是青霉2.2 滤纸分解度观察结果见表22.3 酶活力测定结果将分离到的两株菌分别接种一环到装有50mL液体培养基的三角瓶中，30C振荡（转速为125 r/min）培养 6 d, 将培养液于4℃、4000 r/rain 离心 15 min, 取上清液作为粗酶液,测其对滤纸分解度，CMCB活力（CMC case）,滤纸糖化力 （FPA） 和天然纤维素酶活力 , 结果见表 3。

3 讨论自 20 世纪 60 年代以来 , 人们对纤维素酶活力测定方法进行了大量的研究, 提出了许多不同的测定方法.1984 年, 国际理论和应用化学协会的发酵委员会确认滤纸酶活力测定法为标准方法 ,滤纸酶活力法测定总酶活力虽然是一种通用的、 公认的、 经典的方法 , 但 由于其底物为滤纸是不溶性的 , 结构比较复杂, 不同厂家生产的滤纸也不同 , 对实验结果有一定的影响 , 因此 , 对滤纸品种的要求也十分严格. 在近来的总酶活力测定过程中发现, 国产滤纸的质量有所变化 , 其本底值过高 , 给测定带来较大的误差 , 而且作为底物的滤纸需要裁成一定重量的小条, 比较麻烦 . 对于活力较低的样品来说, 其灵敏度较差, 更为主要的是这种方法的反应时间比较长, 不利于快速测定, 这在生产中是很不方便的 在通常情况下 , 影响酶活力的因素较多 , 如酶的浓度、 底物的结构和性质、pH值、反应温度等.另外纤维素酶活力的测定方法也很多,至今没有统一, 这就造成了相互之间无法比较活力的情况 , 本实验采用了测定各菌株在作物秸秆纤维素中表现出的纤维素酶活力 , 更具有生产上的意义。