反义hTERT体外诱导肺癌细胞凋亡的研究.doc

1反义 hTERT 体外诱导肺癌细胞凋亡的研究作者：尹为华，马雅，李若馨，孙来保【摘要 】 目的 研究反义 hTERT 基因体外诱导肺癌细胞凋亡方法 体外通过 SuperFect（QIAGEN）转染正、反义 hTERT 真核表达载体至人肺腺癌细胞株 GLC-82，再经过 G418 及 PCR 筛选鉴定获得分别转入了正、反义 hTERT 载体的抗性克隆细胞 GLC-82-s 和GLC-82-as然后采用 MTT 法、双层软琼脂克隆形成实验、流式细胞术观察和分析了反义 hTERT 对肺癌细胞体外生长增殖活力的影响及是否能诱导瘤细胞的凋亡；同时我们还运用实时荧光定量 RT-PCR 技术及 TRAP-银染法对各组细胞内源性 hTERT mRNA 的表达情况及端粒酶的活性进行了检测结果 当各组细胞传至第 25 代后，与 GLC-82、GLC-82-s 比较，GLC-82-as 细胞的生长速度和集落形成能力明显地减慢和降低，同时伴有凋亡率的显著增加；与空白对照、正义 hTERT 组相比，反义 hTERT 能显著地降低 GLC-82 细胞内源性 hTERT mRNA 的表达（P<0.01）和下调端粒酶活性。

结论 反义 hTERT 体外确实能明显地诱导肺癌细胞的凋亡及抑制瘤细胞的生长增殖能力关键词】 反义 hTERT；肺癌；凋亡；细胞增殖；实时荧光定量 RT-PCR2【Abstract】 Objective To study the cell apoptosis of lung cancer induced by antisense hTERT in vitro. Methods The sense and antisense hTERT eukaryotic expression vectors were transfected into lung cancer cell line GLC-82 using the SuperFect transfection reagent (Qiagen) according to the manufacturer’s instructions， then the GLC-82-s and GLC-82-as of G418-resistant colonies were obtained with G418 and identified for the presence of hTERT insert by PCR with T7 and pcDNA3.1/BGH reverse primers. After that， MTT cellular proliferation assay， soft agar colony formation assay and flow cytometry were adopted to analyze if the proliferation capacity of lung cancer cell were effected in vitro and the tumor cells can be induced to apoptosis by antisense hTERT. Meanwhile， we have also detected the endogenous hTERT mRNA expression and telomerase activity by quantitative real-time RT-PCR and TRAP-silver staining assay in each group cells.Results After 25 passages of three group cells， a 7-day cell growth curve and the numbers (size) of soft agar colony formation showed the proliferation rates and the anchorage-independent growth ability in GLC-82-as were 3significantly decreased and reduced， compared with GLC-82 and GLC-82-s. But there was a significant increase in apoptosis percentage of GLC-82-as by flow cytometry， compared with control groups. Antisense hTERT can remarkably reduce the endogenous hTERT mRNA expression (P<0.01) and down-regulate telomerase activity in GLC-82， compared with blank control and sense hTERT groups.Conclusion Antisense hTERT can obviously induce cell apoptosis and inhibit growth/proliferation of lung cancer cell in vitro. 【Key words】 antisense hTERT；lung cancer；apoptosis；cell proliferation；quantitative real-time RT-PCR端粒酶是一种 RNA 依赖的 DNA 多聚酶，其主要功能是补充合成端粒 DNA；目前已证实端粒酶至少由两种主要成分构成：一种为从头合成端粒 DNA 提供模板的人端粒酶 RNA（hTR）组份，另一为人端粒酶逆转录酶蛋白催化亚单位（hTERT） ，后者才是其活性表达的关键组份和限速因子（rate-limiting factor） ［1］ 。

大量研究表明端粒酶的激活是肿瘤恶性转变的一个早期事件，与肿瘤的恶性程度成正相关［2，3］ ；同样肺癌及其细胞株也不例外地存在着端粒4酶活性的高表达情况［2］ ，因此封闭和抑制端粒酶使其失活代表着一种恶性肿瘤分子生物治疗的一种新的发展思路，且具有广谱、高效、低毒的应用前景本研究旨在将靶向端粒酶蛋白亚基的反义hTERT 基因真核表达载体转染肺癌细胞 GLC-82，观察其对肺癌细胞体外诱导凋亡及增殖生长的抑制作用，为探索恶性肿瘤治疗新途径奠定实验基础和理论依据1 材料与方法1.1 材料 大肠杆菌 DH5α 及 HeLa 宫颈癌细胞株、人肺腺癌细胞株 GLC-82 为本室冻存，pGEM○R-T 载体为 Promega 公司产品，高效真核表达质粒 pcDNA3.1(±)为 Invitrogen 公司产品，限制性内切酶 BamH I、Xho I 为 NEB 公司产品DNA Ligation Kit 为TaKaRa 产品Advantage-GC 2 PCR Kit 为 Clontech 公司产品G418 购自上海 Sangon，MTT 为美国 Amresco 产品其余的所需分子生物学试剂均为 Qiagen 公司产品。

1.2 正、反义 hTERT 基因真核表达载体的构建与鉴定 参见文献［4］方法1.3 细胞培养 体外常规培养 GLC-82 人肺腺癌细胞，培养液为RPMI 1640（Gibco/BRL）＋10%胎牛血清（HyClone）＋双抗5100u/ml；在含 5%CO2，饱和湿度，37℃培养箱中培养转染后筛选培养液为 RPMI 1640＋10%胎牛血清＋300μg/ml G4181.4 转染及筛选 参见文献［5］进行实验分成 3 组：a 空白对照组，b 正义 hTERT 组，c 反义 hTERT 组最后将正、反义hTERT 组获得的 G418 抗性克隆扩大培养，并将 PCR 鉴定结果分别命名为 GLC-82-s、GLC-82-as 1.5 细胞凋亡的检测 采用 Annexin V-FITC/PI（Pharmingen ）双染色法，操作方法按试剂说明书进行，检测用仪器为美国COULTER EPICS○R ALTRA 流式细胞仪1.6 细胞增殖生长能力的测定 GLC-82、GLC-82-s 及 GLC-82-as 3 组细胞 7 日生长曲线的绘制系采用 MTT 法并参考文献［7］进行，酶标仪为 Bio-Rad Model 550。

双层软琼脂克隆形成实验参考文献［6］方法1.7 实时荧光定量 RT-PCR 对 hTERT 表达水平的检测 具体方法参考文献［7］ 所采用的试剂为罗氏 LightCycler TeloTAGGG hTERT Quantification Kit，使用仪器为罗氏 LightCycler 荧光定量PCR 仪61.8 端粒酶活性测定 采用非放射性 TRAP-银染法，按参考文献［8］进行1.9 统计学方法 采用 SPSS 软件 10.0 版分析2 结果2.1 正、反义 hTERT 基因真核表达载体的构建与鉴定 参见文献［4］ 2.2 正、反义 hTERT 组 G418 抗性克隆是否转入重组体的筛选鉴定 常规提取细胞 DNA 后采用位于 pcDNA3.1 质粒载体多克隆位点两侧的 T7 及 pcDNA3.1/BGH 反向引物进行 PCR 扩增外源性基因片段，结果见图 1 GLC-82-s、GLC-82-as G418 抗性克隆均可见一条大小约 340bp 的特异性条带，而空白对照组则未见，说明GLC-82 人肺腺癌细胞已被成功地转入了正、反义 hTERT 外源重组体7图 1 G418 抗性克隆外源基因片段的 PCR 扩增结果M：100bp ladder Marker；1 ：GLC-82 ；2：GLC-82-s；3：GLC-82-as2.3 反义 hTERT 诱导肺癌细胞凋亡 为了阐明反义 hTERT 是否通过诱导肿瘤细胞的凋亡途径来抑制肿瘤增殖的，我们分别取 GLC-82、GLC-82-s 及 GLC-82-as 3 组传至第 5、25 代的细胞来检测，结果见图 2。

在第 5 代时检测结果显示各组间差异无显著性（资料未显示） 图 2 3 组细胞第 25 代之凋亡百分率 第 25 代时 GLC-82-as 的凋亡率较 GLC-82、GLC-82-s 细胞克隆有显著性增加（P<0.05)图 2 3 组细胞第 25 代之凋亡百分率2.4 反义 hTERT 对肺癌细胞体外增殖生长的抑制作用 分别取GLC-82、GLC-82-s 及 GLC-82-as 3 组传至第 25 代的细胞来绘制7 日生长曲线，结果见图 3从图 3 观察 GLC-82-as 细胞增殖速度8较 GLC-82、GLC-82-s 细胞明显减低，以后 4 天尤为显著（P<0.01） 另外双层软琼脂克隆形成实验亦是用 3 组传至第 25代的细胞来进行的，结果显示 GLC-82-as 细胞无论在集落形成的数量或是大小上均较 GLC-82、GLC-82-s 2 组细胞明显减少、变小，差异有显著性（P<0.01 ） 分别是：GLC-82-as 为25.3±3.8， GLC-82-s 为 112.53±6.02， GLC-82 为126.33±8.06图 3 3 组细胞第 25 代之 7 日生长曲线2.5 反义 hTERT 对端粒酶蛋白亚单位基因表达的影响 为了更精确地反映我们自行构建的反义 hTERT 真核表达载体对肺癌细胞端粒酶蛋白亚单位基因表达的靶向封闭及抑制效果，采用了 LightCycler实时荧光定量 RT-PCR 技术对各组细胞经转染后内源性 hTERT mRNA 表达量的实际变化情况进行了检测，结果见表 1。

正义hTERT 组与空白对照组间差异无显著性，反义组 hTER。