羧甲基壳聚糖逆转骨肉瘤MG-63-ADM细胞耐药性的研究.docx

    羧甲基壳聚糖逆转骨肉瘤MG63/ADM细胞耐药性的研究    丁万军 曾涛 郭卫春[摘要] 目的 觀察羧甲基壳聚糖（CMC）逆转人骨肉瘤耐药细胞株MG-63/ADM的耐药作用并初步探讨其机制方法 体外培养建立人骨肉瘤耐药MG-63/ADM细胞株，MTT检测其耐药性；用不同浓度（50、100、200 μmol/L）CMC+阿霉素2.0 μg/mL作用于骨肉瘤MG-63/ADM细胞24、48、72 h后，采用MTT法测各组细胞生长抑制率；采用Western blot方法检测不同浓度CMC处理后MG-63/ADM细胞P糖原蛋白（P-gp）及胞核中核转录因子-κB P65（NF-κB P65）的表达水平 结果 MTT结果显示MG-63/ADM细胞株对阿霉素（ADM）明显耐药，IC50为（1.97±0.56）μg/mL，耐药指数为11.35；CMC联合ADM 2.0 μg/mL能明显抑制MG-63/ADM细胞的增殖，且其抑制作用与CMC呈时间和剂量依赖性（P < 0.01）Western blot检测结果显示，MG-63/ADM细胞组较MG-63细胞组P-gp的表达水平明显升高（P < 0.05），且用不同浓度CMC处理的MG-63/ADM细胞组P-gp表达均明显低于MG-63/ADM细胞组（不加药物）（P < 0.05）；MG-63/ADM细胞组较MG-63细胞组NF-κB P65的表达水平明显升高（P < 0.05），且不同浓度CMC处理的MG-63/ADM细胞组胞核NF-κB P65表达明显低于MG-63/ADM细胞组（不加药物）（P < 0.05）。

结论 CMC可部分逆转MG-63/ADM细胞的耐药现象的作用，其机制可能与通过抑制NF-κB信号通路激活而抑制P-gp表达相关[关键词] 羧甲基壳聚糖；骨肉瘤；耐药；MG-63细胞株[] R738 [] A [] 1673-7210（2018）09（c）-0004-05[Abstract] Objective To observe the effect of reversing drug resistance of carboxymethyl chitosan （CMC） on human osteosarcoma resistant cell line MG-63/ADM and preliminary explore its mechanism. Methods Human osteosarcoma drug resistant MG-63/ADM cell line was cultured in vitro. The drug resistance was detected by MTT； after 24， 48 and 72 h of osteosarcoma MG-63 /ADM cells were treated with CMC + adriamycin 2.0 μg/mL， and the inhibition rate of cell proliferation in each group was measured by MTT method. The expression of P-gp in MG-63/ADM cells and the expression of NF-κB P65 protein in nucleus of MG-63/ADM cells after treated with the different concentrations of CMC were detected by Western blot. Results MTT results showed that MG-63/ADM cells were resistant to adriamycin， IC50 was （1.97±0.56） g/mL， the resistance index was 11.35； CMC could significantly inhibit MG-63/ADM cells proliferation， and the inhibitory effect was time and dose dependent （P < 0.01）. Western blot test results showed that the expression of P-gp in MG-63/ADM group was significantly higher than that in MG-63 group （P < 0.05）， and the expression of P-gp in MG-63/ADM treated with different concentrations of CMC was significantly lower than that in MG-63/ADM group （without drugs） （P < 0.05）. The expression level of NF-κB/P65 in MG-63/ADM group was significantly higher than that in MG-63 cell group （P < 0.05）. The expression of NF-κB P65 in the nucleus of CMC + ADM group was significantly lower than that of the control group （MG-63/ADM） （P < 0.05）. Conclusion Carboxymethyl can partly reverse the multidrug resistance in MG-63/ADM cells， and its mechanism may be related to the inhibition of NF-κB signaling pathway and the inhibition of P-gp expression.[Key words] Carboxymethyl chitosan； Osteosarcoma； Drug resistance； MG-63 cell line骨肉瘤是发病率最高的原发性骨恶性肿瘤，多见于10～20岁青少年，恶性程度高，易复发和转移，且预后差[1]。

骨肉瘤好发于四肢骨，上肢多发生于肱骨近端，下肢多发生于胫骨近端以及股骨远端骨肉瘤传统的治疗方法是截肢术[2]20世纪80年代以来，逐步形成了新辅助化疗联合保肢手术及术后辅助化疗的新的骨肉瘤治疗策略，使患者5年生存率较之前提高近50%[3]虽然保肢手术已经很成熟，然而仍有部分患者因肿瘤复发转移使得保肢治疗失败，导致治疗效果不佳其主要原因之一是这部分患者对骨肉瘤的化疗药物产生了多药耐药（multidrug resistance，MDR）[4]因此，进一步明确骨肉瘤耐药的机制并寻找能预防或逆转耐药的方法既是目前骨肉瘤治疗研究的热点之一，也是临床迫切需要解决的问题甲壳素是自然界中存在的唯一带陽离子的天然多糖，广泛存在于虾、蟹等甲壳动物及各类昆虫的表皮；甲壳素脱乙酰化的产物称为壳聚糖[5]（chitosan，CTS）羧甲基壳聚糖（carboxymethyl chitosan，CMC）为壳聚糖羧甲基基团修饰后的衍生物有研究表明，CTS及CMC具有一定的抗肿瘤、抗炎、调节免疫等活性[6-7]CMC是否对耐药细胞有逆转耐药作用，目前临床鲜有报道本研究采用阿霉素（ADM）浓度递增培养法冲击诱导建立人骨肉瘤阿霉素耐药株（MG-63/ADM），观察CMC对体外培养的MG-63/ADM细胞对ADM的耐药逆转作用，并初步探讨其可能机制。

1 材料与方法1.1 主要试剂与仪器人骨肉瘤MG-63细胞株（购自武汉大学典型培养物保藏中心）；RPMI 1640培养基（美国，Hyclone）；胎牛血清（FBS）（美国，Gibco）；MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒（碧云天生物科技有限公司）；青霉素、链霉素溶液（双抗）（美国，HyClone）；Trizol（美国，Invitrogen）；阿霉素（Doxorubicin，ADM）由Sigma公司提供；MTT试剂盒（武汉科昊佳生物科技有限公司）；羧甲基壳聚糖（武汉大学资环学院惠赠）；蛋白抽提-亚细胞结构胞浆和胞核蛋白提取试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司），Western blot单克隆抗体均购自Santa Cruz公司；细胞培养瓶及96孔培养板由Coring公司生产，细胞培养箱（美国，Thermo）；Olympus IX70倒置荧光显微镜（日本，Olympus）；自动细胞计数器（美国，Thermo）；紫外凝胶成像系统（美国，Bio-Rad）；DYCz-24D型双垂直电泳槽（北京六一仪器厂）；JY-ECP3000型高压多用电泳仪（北京君意仪器有限公司）；UV-1000紫外透射分析仪（上海鄂禾仪器有限公司）；Lambda Bio 20型紫外-可见分光光度计（美国，PerkinElmer）。

1.2 观察指标及检测方法1.2.1 MG-63细胞ADM耐药株的建立 按文献方法[8-9]，先用低浓度的ADM诱导作用MG-63细胞，然后ADM浓度逐步递增，通过间歇作用的方法诱导细胞耐药首先，取对数生长期MG-63细胞接种至含ADM的DMEM培养液中，ADM从0.05 mg/L的低浓度开始，作用48 h后即弃去含ADM的培养液，重新加入不含ADM的培养液培养，使其恢复正常生长，待MG-63细胞生长至培养瓶底80%～90%时进行胰酶消化传代，随后用浓度为0.1 mg/L的ADM处理传代肿瘤细胞48 h按以上方法，重复ADM处理、换液培养、传代的培养过程，在此过程中按照0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 μg/mL逐步递增ADM药物浓度将MG-63细胞在2 μg/mL的ADM中可以稳定生长时所获得的耐药细胞株命名为MG-63/ADM，整个耐药诱导历时70 d整个试验过程中每4周重复检测1次该细胞的耐药性1.2.2 MG-63/ADM细胞的耐药性检测（MTT法） 将MG-63、MG-63/ADM用DMEM培养液，于培养箱中37℃，5%CO2条件下培养，待两种细胞均生长至培养瓶底80%～90%时行0.25%胰酶消化，然后800 r/min离心10 min，去除上清，分别收集两种细胞并接种于96孔板（1×104/孔），继续DMEM培养24 h后分组培养。

处理组：加入含2 μg/mL浓度ADM的DMEM培养液；阴性对照组：加不含药物的培养基；空白调零组：无细胞，只加培养基，每组设6个复孔将各组细胞继续培养，各组均取24、48、72 h时间点去除培养基行MTT检测按MTT试剂盒方法，每孔加入100 μL的MTT溶液，继续培养4 h去除上清（不能移走结晶），每孔加入150 μL的二甲基亚砜，摇床低速震荡10 min待结晶溶解，全自动酶标仪测定OD值（490 nm吸光度）细胞抑制率（inhibition rate，IR）计算公式：IR（%）=1-[（实验组OD值-调零组OD值）/（对照组OD值-调零组OD值）]×100%根据文献方法[10]，采用SPSS 18.0 probit analysis法计算ADM对MG-63、MG-63/ADM细胞的半数抑制浓度（half effective inhibition concentrations，IC50）；根据IC50的值计算耐药指数（resistance index，RI），RI=耐药组IC50/亲代细胞IC501.2.3 MTT检测CMC对人MG-63/ADM细胞增殖活性的影响 培养MG-63/ADM细胞至培养瓶底80%～90%时（对。