纤维蛋白原的检测方法及进展.ppt

李志芳纤维蛋白原及其检测进展纤维蛋白原及其检测进展v即凝血因子I，是血浆中含量最高的一种凝血蛋白．是凝血系统的核心蛋白质，它在凝血过程的最后阶段被凝血酶转化成纤维蛋白单体，最终形成不溶性纤维蛋白凝块而发挥血液凝固作用纤维蛋白原纤维蛋白原(flbfinogen，，Fg)vFg是分子量为340 KDa的血浆糖蛋白，由肝细胞和巨核细胞合成，约占血浆总蛋白的2 ～3 % 健康人血浆中浓度为2．0～4．0 g／L，电泳分离显示在β2区带v在结构上Fg是由两条Aα链、两条Bβ链和两条γ链组成，每三条肽链（Aα、Bβ、γ肽链）绞合成索状，形成两条索状肽链，两者的N-端通过二硫键相连，整个分子成纤维状纤维蛋白原结构纤维蛋白原结构纤维蛋白原功能纤维蛋白原功能v血浆Fg主要的生理功能是作为凝血蛋白(又称凝血因子)直接参与体内凝血过程，是纤维蛋白的前体，在凝血机制中参与凝血共同途径，由可溶性Fg转变为不可溶性纤维蛋白，使血液凝固主要功能是它的可凝固性)v机制：机制：在凝血酶作用下，纤维蛋白原分子中的两条α链的A肽和两条β链的B肽都断裂，形成纤维蛋白单体 ，凝血酶对纤维蛋白原的 γ链无裂解作用v纤维蛋白单体生成后即开始聚合成纤维蛋白。

在纤维蛋白稳定分子（ⅩⅢa）作用下，经过共价交联的纤维蛋白网更加牢固纤维蛋白与凝血酶有高亲和力，因此纤维蛋白生成后即能吸附凝血酶，有助于局部血凝块的形成v当Fg值超过正常参考范围(2．0～4．0 g／L)时，即表示凝血功能异常；若低于1．5 g／L时，机体出血的概率明显增加 vFg同时又是一种急性时相反应蛋白，其增加往往是机体的一种非特异性反应，血浆Fg升高（＞4g/L）见于糖尿病、急性传染病、肾病综合症、妊高症、心脑血管疾病、恶性肿瘤等v纤维蛋白原减少（＜2g/L）见于弥散性血管内凝血、原发性纤溶症、重症肝炎等纤维蛋白临床意义纤维蛋白临床意义纤维蛋白原与心脑血管疾病纤维蛋白原与心脑血管疾病v心脑血管疾病是现代人群中的常见病，其发生大都存在着Fg的异常增高 Fg是血浆黏度增高的主要因子,Fg能增强红细胞和血小板聚集性，提高全血黏度，使血液处于高凝和高黏状态，影响组织血液灌注，促使血栓形成纤维蛋白原与肾病糖尿病纤维蛋白原与肾病糖尿病v肾病综合征及慢性肾病患者均存在高凝状态，Fg含量增高为其重要特征v机制：尿中大量丢失以白蛋白为主的小分子量蛋白质，出现低蛋白血症，刺激肝脏代偿性合成蛋白质增多，血浆Fg和凝血因子Ⅷ活性增高被认为是肝脏合成蛋白质增多的一种表现，这两种高分子量的凝血前质不能由尿丢失，它们在血浆中的高浓度、高活性是肾病综合征血栓形成的部分危险因素。

v糖尿病是血栓前状态，其血浆黏度、Fg浓度均明显高于正常v改善体内血浆黏度和Fg含量对控制和治疗肾病糖尿病有着重要的意义纤维蛋白原与纤维蛋白原与DICv纤维蛋白原减低见于DIC：弥漫性血管内凝血，激活纤维蛋白溶解酶原，使血中纤维蛋白溶解酶活力增加，溶解纤维蛋白，消耗体内原有的Fg，使其含量减少 纤维蛋白原的检测方法纤维蛋白原的检测方法v近年来对纤维蛋白原的测定日益重视，对其测定的精度也提出了更高的要求 ：美国规定检测结果在靶值±20％ 的范围内，目前测定主要包括Fg血浆水平、亚组分(HF和LF) 、纤维蛋白单体聚集功能、基因多态性等几个方面，其中血浆Fg含量测定最为常用v血浆Fg含量测定方法多达数十种，按原理分为三类，即功能、物理化学和免疫学测定法v(一一)功能测定法功能测定法 该法又称为可凝固蛋白法，即将Fg作为可凝固蛋白来测定，因普遍认为Fg的主要特性是其可凝性，所以血浆可凝固Fg的检测已成为Fg的主要评判标准v功能测定法利用Fg特异的2种生化反应，即凝血酶的蛋白水解作用和随后发生的纤维蛋白单体聚集为纤维蛋白多聚体在这些 方法中，通过加入凝血酶形成纤维蛋白凝块后的检测手段不同，又可分为重量测定法、酚试剂比色法、紫外光度法、浊度法和凝血酶凝固时间法等。

v1．重量测定法．重量测定法 将Fg转变成纤维蛋白凝块经反复洗涤脱水后，用精密天平(精确到0．000 1 g)称重该法简单，不需要复杂的操作或精密仪器，技术误差很小在80年代有一些大型流行病学研究将该法作为参考方法v2．酚试剂比色法．酚试剂比色法 在世界卫生组织(wH0)推荐的参考方法出来前曾作为参考方法该法将过量的凝血酶加入血浆中，将产生的纤维蛋白凝块洗涤数次后溶于NaOH溶液中用Folin—Ciocalteau酚试剂或Biuret反应来测定v3.紫外光度法紫外光度法 该法将纤维蛋白凝块溶解于碱性尿素溶液中，然后通过在280nm波长紫外光直接比色计算纤维蛋白原的含量 在此基础上，又发展成为2种参考方法，即Ancrod法和改良的Jacobsson法 vAncrod法: Ancrod(凝血酶代替品)对Fg有高特异性，不象凝血酶会作用于除Fg外的其他几种血浆蛋白，如因子Ⅷ 纯化的Ancrod只作用于a链并释放A纤维蛋白肽，而不会被血浆中的肝素抑制，并对纤维蛋白降解产物灵敏度低在许多方法不能检测到Fg的低浓度血浆中，该法仍有大量凝块形成，而且比酚试剂比色法重复性更好。

此法在70年代的一些方法学研究中曾作为参考方法v改良的改良的Jacobsson法法 是WHO推荐的参考方法，为第1个血浆Fg国际标准品(89／644)制备时所推荐使用的方法该法准确并满足2项有效测定Fg的主要标准：首先通过凝血酶将可凝固的Fg从血浆中分离出来，其次使用了简便的分光光度法独立操作的定量步骤.v4．浊度法．浊度法 该法原理是用凝血酶凝固的血浆，纤维蛋白形成增加了浊度，并达到一个与Fg浓度成比例的最后浊度这种方法灵敏度低，对Fg的最低检测限为0.5 g／Lv5．动态．动态Fg测定法测定法(kinetic fibrinogen assay，，KFA) 该法基于纤维蛋白凝块形成的动态反应，通过类似凝血酶将Fg转化为纤维蛋白的作用，测定由于纤维蛋白聚集而引起的浓度增加该法使用由天然血浆提供的凝血因子，因此非常近似凝血酶和Fg在体内的反应KFA法不仅可靠准确而且可全自动化，在常规检测中极为简便快速该法与WHO推荐的参考方法和Claus法均有很好的相关性，且不受肝素和香豆素治疗的影响v6. von Clauss法 这是美国国家临床实验室标准化委员会(NCCLS)推荐的常规方法，是最常用的可凝固法，美国1975年使用率已占94％ ，此法具有简单、方便、快速、亦可达到一定精密度和准确度的优点 卫生部临床检验中心1999年也VonClauss法为常规测定方法v原理原理：凝血酶可将可溶性血浆纤维蛋白原转变成不溶性的多倍体纤维素，在高浓度凝血酶及低浓度纤维蛋白原Fg(0．05～0．8 g／L)的条件下．血浆凝固时间由纤维蛋白原浓度决定，在双对数坐标纸上作图，凝血酶凝固时间与纤维蛋白原浓度呈负相关的线性关系v功能法准确特异，是wH0推荐的参考方法(Jacobsson法)和NCCLS推荐的常规方法。

但这类方法的缺点是：在2个方面可引起测定误差，一是测定的是纤维蛋白而非Fg已知Fg变成纤维蛋白时，会切下2个短肽，这样，纤维蛋白实际上比Fg的质量少了约10％二是纤维蛋白一旦形成，就会吸附一些凝血因子或纤溶因子，这样又会增加所测Fg的量此外，在获得纤维蛋白和洗涤时比较麻烦且难以做到完全彻底，还容易造成污染另外还易受肝素等抗凝药物影响v(二二)物理化学测定法物理化学测定法 这类方法在我国应用最广，可分为盐析法、热沉淀法和电泳法等几种v1．盐析法．盐析法 即通过亚硫酸钠、硫酸铵、甘氨酸或氯化钠等盐析后用蛋白质显色剂显色或比浊法测定，常见的方法如双缩脲法，即使用12．5％ 亚硫酸钠溶液将血浆中Fg沉淀分离，然后以双缩脲试剂显色常用的盐溶液中，除甘氨酸为特异性沉淀外，其余均为非特异性沉淀，而甘氨酸的特异性也仅限于正常血浆；在异常血浆中，甘氨酸的沉淀特异性会受到很大干扰所以，现在普遍认为这类方法欠准确v2、热沉淀法、热沉淀法 即将血浆加热到56℃，沉淀的Fg 用离心或非免疫学的浊度法测定这类方法简单快速，适于宽范围的Fg浓度测定，且纤维蛋白降解产物即使处于高浓度也不会干扰此法，但特异性仍较差，一些研究指出该法与Clauss法的结果差异有显著性。

v3．电泳法．电泳法 原理是利用Fg电泳时特征性的迁移率但Fg是一种相对较少的蛋白成分，故密度测定扫描在一定程度上不准确，而且这种方法太繁琐、费时，不适于常规工作v这类方法都比较简单、快速，尤其适于急诊检验，但缺点是本法的特异性不强所测的不是有凝固功能的纤维蛋白原，可能包括部分的降解产物和/或其它蛋白而电泳法又太繁琐，不适于常规工作 v(三三)免疫学测定法免疫学测定法 这类方法是将纯Fg作为抗原免疫动物，制成多克隆或单克隆抗体，然后用其致敏胶乳或以被动或反向血凝、免疫比浊、单向免疫扩散、火箭电泳、放射免疫及ELISA 等免疫学技术测定Fgv免疫学方法简便快速(除RIA)，与参考方法及Claus法的结果比较相关性好，但除可凝固的Fg外，还可测定变性Fg(如无功能Fg )和Fg降解产物(如果采用多克隆抗体)v当Fg存在异质性(如恶性肿瘤、纤溶综合征、消耗性凝血病等)时不会对免疫法产生明显干扰但由于血浆中存在大量无功能的Fg，用功能法测定时结果明显偏低，而用免疫法或物理化学法测定，结果多正常总的说来，免疫学方法用于临床常规实验室仍存在一定问题 (四四)其他方法或技术其他方法或技术v1．．PT演算法演算法 该法根据PT测定完成时，全部Fg均变成纤维蛋白，其形成的浊度或A 改变值与纤维蛋白的含量呈正比，因此可由产生的浊度推算出Fg含量。

该法常见于一些自动血凝分析仪上，测定PT的同时报告Fg值一些文献报道，在Fg含量正常时，该法与ClausS法相关性好，但当Fg减低时，结果可能偏高所以，虽然该法经济、简单、快速，但如发现Fg含量较低或较高，应改用Clauss法也有学者认为PT演算法与Clauss,法在正常及异常范围均有明显差异v2．粘度测定法．粘度测定法 由于Fg外形呈球状且较大，故对血浆粘度影响很大，因此可通过从血浆粘度中扣除血清粘度来测定粘度测定法与Clauss法相关性较好，其重复性比Clauss法在低Fg浓度时略差，在中等浓度时相当，在高浓度时稍好一些，其所需标本量相对较大虽然这是一种老方法，但对拥有毛细血管粘度计的实验室不失为一种廉价、快速且重复性好的可选方法v总之，所有血浆Fg测定方法中，功能法的精密度、准确度、与参考方法的相关性最好，其中又以clauss 法为佳物理化学法虽然相关性和精密度尚可，但准确度较差，免疫法也是如此现有方法除本身存在不足之处外，还有许多干扰因素，如纤维蛋白(原)降解产物、抗凝药物等；另功能法还受Fg异质性的影响v在血凝仪上测定纤维蛋白原方法主要有两种，一是Von clauss法，另一种是PＴ演算法v2008年室间质评中有70家（38%）的实验室使用Clauss法，有43家（23.4%）使用PT一衍生法，40%实验室填报其它（不清楚检测方法）项项目目批号批号组组实验室数实验室数平均值平均值标准差标准差变异系数（变异系数（%）） 最大值最大值最小值最小值FIB200806缺省组缺省组154294.2 24.63 8.37 368.0 235.0 PT演算法组演算法组32302.8 25.77 9.39 378.7 264.9 Clauss法组法组67290.6 27.28 8.51 368.0 235.0 200807缺省组缺省组162349.2 42.41 12.15 448.0 230.0 PT演算法组演算法组35360.6 49.22 13.65 489.0 232.0 Clauss法组法组68347.6 39.39 11.33 443.1 264.0 200808缺省组缺省组162351.2 46.20 13.15 477.3 217.0 PT演算法组演算法组35363.8 53.40 14.68 499.0 217.0 Clauss法组法组68349.4 40.95 11.72 463.3 236.0 200809缺省组缺省组161351.0 46.09 13.13 485.3 221.0 PT演算法组演算法组33357.7 46.71 13.06 445.6 221.0 Clauss法组法组67347.5 40.89 11.77 437.1 226.0 200810缺省组缺省组161350.0 48.34 13.81 490.0 218.0 PT演算法组演算法组36371.6 76.62 20.62 596.3 218.0 Clauss法组法组68348.4 42.49 12.19 463.3 231.1 血浆血浆Fg测定的标准化测定的标准化vl ．．血血浆纤维蛋白原测定的标准浆纤维蛋白原测定的标准品品　在国际参考制品出现前，Fg的检测方法多种多样，同一方法的试剂盒其生产商所用的标准品也不尽一致，有研究将这些标准品进行比较后发现可凝固Fg差异可达200％。

因此，需要建立一个国际标准品，以标定各地区的二级标准品，并实现逐级质控，从而促使全球血浆Fg含量的检测既具有广泛的可比性，又尽可能准确可靠vWHO组织研究并于1992年建立了第1个血浆Fg国际标准品(编号89／644，取值2．4 mg／m1) ，迈出了Fg标准品标准化的关键一步该标准品建立后，其使用得到普及，但该标准品在复溶时有些混浊，长期存放后尤为明显WHO于1999年又建立了第2个血浆Fg国际标准品(编号98／612，取值2．2 mg／安瓿)以代替前一标准品经过近几年的普及，血浆Fg测定的标准化已经成形 2.纤维蛋白原（纤维蛋白原（Fg）测定的推荐方法）测定的推荐方法vJocobsson法为世界卫生组织(WHO) 推荐的参考方法，而Von Clauss法是美国国家临床检验标准委员会(NCCLS)推荐的纤维蛋白原的常规测定方法vFg测定的标准化还包括标本、试剂、仪器、技术和操作等几个方面国际血液学标准化委员会(ICSH)、国际血栓与止血委员会(ICTH) 标准化方案有了较明确的规定v小结小结:血浆Fg 的测定已由过去种类多、可靠性参差不齐、标准化方案缺乏发展到现在方法及标准品的国际化。

如今全自动分析逐渐代替了手工操作可以预期，随着新技术、新方法的引进，血浆的测定会日趋规范、准确和可靠． 谢谢！谢谢！。