致病菌检验方法((cly).ppt

致病菌检测方法致病菌检测方法福建省疾病预防控制中心 陈路瑶需要检测的致病菌需要检测的致病菌 乙型溶血链球菌乙型溶血链球菌 大肠杆菌大肠杆菌 绿脓杆菌绿脓杆菌 金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌 志贺氏菌志贺氏菌 沙门氏菌沙门氏菌溶血性链球菌溶血性链球菌 检测依据：检测依据：GB/T 4789.11-2003GB/T 4789.11-2003 食品卫生微生物学检验食品卫生微生物学检验 溶血性链球菌检验溶血性链球菌检验检验程序检验程序检检 样样 葡萄糖肉汤葡萄糖肉汤血平板血平板血平板（分纯培养）血平板（分纯培养）链激酶试验链激酶试验杆菌肽敏感试验杆菌肽敏感试验观察溶血观察溶血革兰氏染色革兰氏染色报报 告告36℃±1℃ 24h 36℃±1℃36℃±1℃24h24h1、菌落特征：、菌落特征：溶血性链球菌菌落溶血性链球菌菌落特征：灰白色细小特征：灰白色细小针尖样菌落周围针尖样菌落周围形成一个形成一个2-4mm2-4mm宽、宽、界限分明、完全透界限分明、完全透明的无色溶血环明的无色溶血环。

2、革兰氏染色：、革兰氏染色：乙型溶血性链球菌乙型溶血性链球菌为革兰氏阳性球菌，为革兰氏阳性球菌，在镜下呈现为蓝紫在镜下呈现为蓝紫色，圆形，链状排色，圆形，链状排列 3、杆菌肽敏感试验、杆菌肽敏感试验乙型溶血性链球菌乙型溶血性链球菌对杆菌肽敏感，在对杆菌肽敏感，在涂布了该菌菌液的涂布了该菌菌液的血平板上贴上杆菌血平板上贴上杆菌肽，肽，3636℃℃培养培养18~18~24h24h，如果有大于，如果有大于10mm10mm的抑菌带出的抑菌带出现即为阳性现即为阳性 4、链激酶试验、链激酶试验乙型溶血性链球菌能产生乙型溶血性链球菌能产生乙型溶血性链球菌能产生乙型溶血性链球菌能产生链激酶，能激活正常人体链激酶，能激活正常人体链激酶，能激活正常人体链激酶，能激活正常人体 血液中的血浆蛋白酶原，血液中的血浆蛋白酶原，血液中的血浆蛋白酶原，血液中的血浆蛋白酶原， 凝固凝固凝固凝固形成血浆蛋白酶，而后溶形成血浆蛋白酶，而后溶形成血浆蛋白酶，而后溶形成血浆蛋白酶，而后溶解纤维蛋白。

试验中，能解纤维蛋白试验中，能解纤维蛋白试验中，能解纤维蛋白试验中，能使凝固的血浆完全溶解为使凝固的血浆完全溶解为使凝固的血浆完全溶解为使凝固的血浆完全溶解为 溶解溶解溶解溶解链激酶试验阳性链激酶试验阳性链激酶试验阳性链激酶试验阳性 大肠杆菌大肠杆菌依据：依据：GB15979-2002GB15979-2002一次性使用卫生用品卫生标准一次性使用卫生用品卫生标准 附录附录B3 B3 大肠菌群检测方法大肠菌群检测方法1 1、发酵试验、发酵试验取样液取样液取样液取样液5ml5ml5ml5ml接种接种接种接种50ml50ml50ml50ml乳糖乳糖乳糖乳糖胆盐发酵管，置胆盐发酵管，置胆盐发酵管，置胆盐发酵管，置37℃37℃37℃37℃培养培养培养培养24h24h24h24h，如不产酸不产气，，如不产酸不产气，，如不产酸不产气，，如不产酸不产气，则报告为阴性，如产酸产则报告为阴性，如产酸产则报告为阴性，如产酸产则报告为阴性，如产酸产气，则进行下一步试验气，则进行下一步试验气，则进行下一步试验气，则进行下一步试验。

2 2、接种平板、接种平板乳糖胆盐发酵试验阳性的管，乳糖胆盐发酵试验阳性的管，乳糖胆盐发酵试验阳性的管，乳糖胆盐发酵试验阳性的管，划线接种伊红美蓝平板典划线接种伊红美蓝平板典划线接种伊红美蓝平板典划线接种伊红美蓝平板典型的大肠杆菌菌落为黑紫色型的大肠杆菌菌落为黑紫色型的大肠杆菌菌落为黑紫色型的大肠杆菌菌落为黑紫色或红紫色，圆形，边缘整齐，或红紫色，圆形，边缘整齐，或红紫色，圆形，边缘整齐，或红紫色，圆形，边缘整齐，表面光滑湿润，有金属光泽，表面光滑湿润，有金属光泽，表面光滑湿润，有金属光泽，表面光滑湿润，有金属光泽，也有的呈紫黑色，不带或略也有的呈紫黑色，不带或略也有的呈紫黑色，不带或略也有的呈紫黑色，不带或略带金属光泽，或粉红色，中带金属光泽，或粉红色，中带金属光泽，或粉红色，中带金属光泽，或粉红色，中心较深的菌落心较深的菌落心较深的菌落心较深的菌落3 3、革兰氏染色、革兰氏染色取疑似菌落作革兰氏取疑似菌落作革兰氏取疑似菌落作革兰氏取疑似菌落作革兰氏染色镜检，大肠杆菌染色镜检，大肠杆菌染色镜检，大肠杆菌染色镜检，大肠杆菌为革兰氏阴性杆菌，为革兰氏阴性杆菌，为革兰氏阴性杆菌，为革兰氏阴性杆菌，镜下呈红色杆状。

镜下呈红色杆状镜下呈红色杆状镜下呈红色杆状5 5、复发酵、复发酵伊红美蓝平板上的伊红美蓝平板上的伊红美蓝平板上的伊红美蓝平板上的疑似菌落在染色镜疑似菌落在染色镜疑似菌落在染色镜疑似菌落在染色镜检的同时接种乳糖检的同时接种乳糖检的同时接种乳糖检的同时接种乳糖发酵管，如有产酸发酵管，如有产酸发酵管，如有产酸发酵管，如有产酸产气，则可报告检产气，则可报告检产气，则可报告检产气，则可报告检出大肠杆菌出大肠杆菌出大肠杆菌出大肠杆菌绿脓杆菌绿脓杆菌依据：依据：GB7918.4-87GB7918.4-87 化妆品微生物标准检验方法化妆品微生物标准检验方法 绿绿 脓脓 杆杆 菌菌检验程序：检验程序：增增 菌菌 培培 养养分分 离离 培培 养养染染 色色 镜镜 检检氧化酶试验氧化酶试验绿脓菌素试验绿脓菌素试验硝酸盐还原产气试验硝酸盐还原产气试验明胶液化试验明胶液化试验42℃42℃生长试验生长试验 报报 告告37℃37℃培养培养1818~24h24h 37℃37℃培养培养1818~24h24h 1 1、增菌培养、增菌培养如有绿脓杆菌生长，如有绿脓杆菌生长，如有绿脓杆菌生长，如有绿脓杆菌生长，培养表面多有一层培养表面多有一层培养表面多有一层培养表面多有一层薄菌膜，培养液常薄菌膜，培养液常薄菌膜，培养液常薄菌膜，培养液常呈黄绿色或蓝绿色呈黄绿色或蓝绿色呈黄绿色或蓝绿色呈黄绿色或蓝绿色 2 2、分离培养、分离培养绿脓杆菌菌落扁平无定型，向周边扩散或略有蔓延，表面湿绿脓杆菌菌落扁平无定型，向周边扩散或略有蔓延，表面湿绿脓杆菌菌落扁平无定型，向周边扩散或略有蔓延，表面湿绿脓杆菌菌落扁平无定型，向周边扩散或略有蔓延，表面湿润，菌落呈灰白色，菌落周围培养基常扩散有水溶性色素。

润，菌落呈灰白色，菌落周围培养基常扩散有水溶性色素润，菌落呈灰白色，菌落周围培养基常扩散有水溶性色素润，菌落呈灰白色，菌落周围培养基常扩散有水溶性色素 3 3、染色镜检、染色镜检取疑似菌落作革兰氏取疑似菌落作革兰氏取疑似菌落作革兰氏取疑似菌落作革兰氏染色镜检，绿脓杆菌染色镜检，绿脓杆菌染色镜检，绿脓杆菌染色镜检，绿脓杆菌为革兰氏阴性杆菌，为革兰氏阴性杆菌，为革兰氏阴性杆菌，为革兰氏阴性杆菌，镜下呈红色短杆状镜下呈红色短杆状镜下呈红色短杆状镜下呈红色短杆状4 4、氧化酶试验、氧化酶试验挑取绿脓杆菌可疑菌落挑取绿脓杆菌可疑菌落挑取绿脓杆菌可疑菌落挑取绿脓杆菌可疑菌落涂在白色滤纸上，加一涂在白色滤纸上，加一涂在白色滤纸上，加一涂在白色滤纸上，加一滴新配制的滴新配制的滴新配制的滴新配制的1%1%1%1%二甲基对二甲基对二甲基对二甲基对苯二胺试液，在苯二胺试液，在苯二胺试液，在苯二胺试液，在15151515~ ~30s30s30s30s内，出现粉红色或紫红内，出现粉红色或紫红内，出现粉红色或紫红内，出现粉红色或紫红色，为阳性，无色或淡色，为阳性，无色或淡色，为阳性，无色或淡色，为阳性，无色或淡黄色为阴性。

黄色为阴性黄色为阴性黄色为阴性5 5、绿脓菌素试验、绿脓菌素试验取可疑菌落接种绿脓菌素鉴取可疑菌落接种绿脓菌素鉴取可疑菌落接种绿脓菌素鉴取可疑菌落接种绿脓菌素鉴定用培养基，定用培养基，定用培养基，定用培养基，37373737℃℃℃℃培养培养培养培养24h,24h,24h,24h,加入氯仿加入氯仿加入氯仿加入氯仿3~5 3~5 mLmLmLmL，充分振荡，充分振荡，充分振荡，充分振荡使培养物中的绿脓菌素溶解使培养物中的绿脓菌素溶解使培养物中的绿脓菌素溶解使培养物中的绿脓菌素溶解于氯仿液中，等氯仿提取液于氯仿液中，等氯仿提取液于氯仿液中，等氯仿提取液于氯仿液中，等氯仿提取液呈蓝色时，用吸管将氯仿移呈蓝色时，用吸管将氯仿移呈蓝色时，用吸管将氯仿移呈蓝色时，用吸管将氯仿移到另一试管内并加入到另一试管内并加入到另一试管内并加入到另一试管内并加入1mol/L1mol/L1mol/L1mol/L的盐酸的盐酸的盐酸的盐酸1 1 1 1 mLmLmLmL，振荡，静置片，振荡，静置片，振荡，静置片，振荡，静置片刻，如上层盐酸内出现粉红刻，如上层盐酸内出现粉红刻，如上层盐酸内出现粉红刻，如上层盐酸内出现粉红到紫红色时，为阳性，表示到紫红色时，为阳性，表示到紫红色时，为阳性，表示到紫红色时，为阳性，表示有绿脓菌素存在。

有绿脓菌素存在有绿脓菌素存在有绿脓菌素存在6 6、硝酸盐还原产气试验、硝酸盐还原产气试验接种被检纯培养物于接种被检纯培养物于接种被检纯培养物于接种被检纯培养物于硝酸盐胨水培养基中，硝酸盐胨水培养基中，硝酸盐胨水培养基中，硝酸盐胨水培养基中，37℃37℃37℃37℃培养培养培养培养 24h24h24h24h小倒管中有气体者，为阳管中有气体者，为阳管中有气体者，为阳管中有气体者，为阳性，表明该菌能还原性，表明该菌能还原性，表明该菌能还原性，表明该菌能还原硝酸盐，产生氮气硝酸盐，产生氮气硝酸盐，产生氮气硝酸盐，产生氮气7 7、明胶液化试验、明胶液化试验将可疑菌落穿刺接种在明胶将可疑菌落穿刺接种在明胶将可疑菌落穿刺接种在明胶将可疑菌落穿刺接种在明胶培养基内，培养基内，培养基内，培养基内，37℃37℃37℃37℃培养培养培养培养24h,24h,24h,24h,取取取取出放冰箱出放冰箱出放冰箱出放冰箱10101010~ ~30min30min30min30min，如何呈，如何呈，如何呈，如何呈溶解状态，即为明胶液化试溶解状态，即为明胶液化试溶解状态，即为明胶液化试溶解状态，即为明胶液化试验阳性，如凝固不溶者为阴验阳性，如凝固不溶者为阴验阳性，如凝固不溶者为阴验阳性，如凝固不溶者为阴性。

性8 8、、42℃42℃生长试验生长试验挑取纯培养物，接种在普通琼脂斜面培养基挑取纯培养物，接种在普通琼脂斜面培养基上，放在上，放在41℃41℃~42℃42℃培养箱中培养箱中24h24h~48h48h，绿脓，绿脓菌能生长，为阳性不能生长为阴性菌能生长，为阳性不能生长为阴性金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌 依据：依据：GB7918.5-87 GB7918.5-87 化妆品微生物标准检验方法化妆品微生物标准检验方法 金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌检验程序检验程序增增 菌菌分分 离离染色镜检染色镜检甘露醇发酵试验甘露醇发酵试验血浆凝固酶试验血浆凝固酶试验报报 告告37℃ 1837℃ 18~24h24h 37℃ 2437℃ 24~48h48h 1 1、增菌：、增菌：取样液按取样液按取样液按取样液按1 1 1 1：：：：10101010比例接比例接比例接比例接种到种到种到种到SCDLPSCDLPSCDLPSCDLP液体培养基液体培养基液体培养基液体培养基中，或者可用中，或者可用中，或者可用中，或者可用7.5 %7.5 %7.5 %7.5 %氯氯氯氯化钠肉汤，置化钠肉汤，置化钠肉汤，置化钠肉汤，置 37℃37℃37℃37℃培培培培养箱，培养养箱，培养养箱，培养养箱，培养24h24h24h24h。

2 2、分离、分离将增菌培养液划线接种将增菌培养液划线接种将增菌培养液划线接种将增菌培养液划线接种于血琼脂平板置于血琼脂平板置于血琼脂平板置于血琼脂平板置37℃37℃37℃37℃培培培培养养养养24242424~ ~48h48h48h48h，菌落呈金黄，菌落呈金黄，菌落呈金黄，菌落呈金黄色，大而突起，圆形，色，大而突起，圆形，色，大而突起，圆形，色，大而突起，圆形，不透明，表面光滑，周不透明，表面光滑，周不透明，表面光滑，周不透明，表面光滑，周围有溶血圈围有溶血圈围有溶血圈围有溶血圈 3 3、染色镜检、染色镜检挑取可疑菌落涂片挑取可疑菌落涂片挑取可疑菌落涂片挑取可疑菌落涂片染色镜检，该菌为染色镜检，该菌为染色镜检，该菌为染色镜检，该菌为革兰氏阳性球菌，革兰氏阳性球菌，革兰氏阳性球菌，革兰氏阳性球菌，排列成葡萄状，蓝排列成葡萄状，蓝排列成葡萄状，蓝排列成葡萄状，蓝紫色4 4、甘露醇发酵试验、甘露醇发酵试验取上述分纯菌落接种取上述分纯菌落接种取上述分纯菌落接种取上述分纯菌落接种到甘露醇发酵培养基到甘露醇发酵培养基到甘露醇发酵培养基到甘露醇发酵培养基中，置中，置中，置中，置 37℃37℃37℃37℃培养箱，培养箱，培养箱，培养箱，培养培养培养培养24h24h24h24h。

金黄色葡金黄色葡金黄色葡金黄色葡萄球菌应能发酵甘露萄球菌应能发酵甘露萄球菌应能发酵甘露萄球菌应能发酵甘露醇产酸5 5、血浆凝固酶试验、血浆凝固酶试验 玻片法：取清洁干燥载玻片上，一端加一滴灭菌生玻片法：取清洁干燥载玻片上，一端加一滴灭菌生玻片法：取清洁干燥载玻片上，一端加一滴灭菌生玻片法：取清洁干燥载玻片上，一端加一滴灭菌生理盐水，另一端滴加一滴血浆，用接种环挑取菌落，理盐水，另一端滴加一滴血浆，用接种环挑取菌落，理盐水，另一端滴加一滴血浆，用接种环挑取菌落，理盐水，另一端滴加一滴血浆，用接种环挑取菌落，分别在生盐及血浆中充分研磨混合血浆与菌在分别在生盐及血浆中充分研磨混合血浆与菌在分别在生盐及血浆中充分研磨混合血浆与菌在分别在生盐及血浆中充分研磨混合血浆与菌在5min5min5min5min内出现团块或颗粒状凝块时，而盐水滴仍呈均内出现团块或颗粒状凝块时，而盐水滴仍呈均内出现团块或颗粒状凝块时，而盐水滴仍呈均内出现团块或颗粒状凝块时，而盐水滴仍呈均匀混浊无凝固现象都为阳性，如两者均无凝固现象匀混浊无凝固现象都为阳性，如两者均无凝固现象匀混浊无凝固现象都为阳性，如两者均无凝固现象匀混浊无凝固现象都为阳性，如两者均无凝固现象则为阴性。

凡玻片试验阴性或盐水滴与血浆滴均有则为阴性凡玻片试验阴性或盐水滴与血浆滴均有则为阴性凡玻片试验阴性或盐水滴与血浆滴均有则为阴性凡玻片试验阴性或盐水滴与血浆滴均有凝固现象，再进行试管凝固酶试验凝固现象，再进行试管凝固酶试验凝固现象，再进行试管凝固酶试验凝固现象，再进行试管凝固酶试验 5 5、血浆凝固酶试验、血浆凝固酶试验 试管法：吸取试管法：吸取1：：4新鲜血浆新鲜血浆0.5ml，加入待检，加入待检菌菌24h肉汤培养物肉汤培养物0.5ml混匀，于混匀，于37℃水浴水浴或恒温箱中，半小时观察一次，或恒温箱中，半小时观察一次，24h 内呈现内呈现凝块为阳性凝块为阳性 5 5、血浆凝固酶试验、血浆凝固酶试验乳胶凝集法金黄色葡萄球菌鉴定试剂盒乳胶凝集法金黄色葡萄球菌鉴定试剂盒乳胶凝集法金黄色葡萄球菌鉴定试剂盒乳胶凝集法金黄色葡萄球菌鉴定试剂盒 志贺氏菌志贺氏菌依据：依据：GB 4789.5-2012GB 4789.5-2012食品安全国家标准食品安全国家标准食品卫生微生物学检验食品卫生微生物学检验 志贺氏菌检验志贺氏菌检验检验程序检验程序检验程序检验程序沙门氏菌沙门氏菌 依据：依据：GB 4789.4-2010GB 4789.4-2010食品安全国家标准食品安全国家标准食品卫生微生物学检验食品卫生微生物学检验 沙门氏菌检验沙门氏菌检验基本操作步骤基本操作步骤1 1、前增菌：、前增菌：BPW(BPW(缓冲蛋白胨水）缓冲蛋白胨水）2 2、增菌：、增菌： TTBTTB（四硫磺酸钠煌绿增菌液）（四硫磺酸钠煌绿增菌液） SC SC （亚硒酸盐胱氨酸增菌液）（亚硒酸盐胱氨酸增菌液）3 3、分离：、分离：① ① BSBS（亚硫酸铋琼脂）（亚硫酸铋琼脂） XLDXLD（木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂）（木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂） ② ② HEHE琼脂琼脂 沙门氏菌显色培养基沙门氏菌显色培养基基本操作步骤基本操作步骤4 4、生化试验：、生化试验：TSITSI（三糖铁）（三糖铁） 赖氨酸赖氨酸 靛基质靛基质 尿素琼脂尿素琼脂 氰化钾（氰化钾（KCNKCN）培养基）培养基 蛋白胨水蛋白胨水或直接用生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统或直接用生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统5 5、血清学鉴定：、血清学鉴定：O O抗原、抗原、H H抗原、抗原、ViVi抗原、菌型鉴定抗原、菌型鉴定。