蜂病毒研究进展.doc

1蜂病毒研究进展作者：马鸣潇， 曲祖乙， 王术德【关键词】 蜂病毒近年来，蜂病毒病对养蜂业的危害越来越引起人们的关注，虽然蜂病毒病没有特征性的临诊症状，但是一旦蜂病毒病暴发就会对蜂群造成毁灭性的打击目前世界范围内至少发现 18 种蜂病毒病，而在我国流行的蜂病毒病主要有中蜂和意蜂的囊状幼虫病（SB） 、蜂蛹病(HBP)、蜜蜂慢性麻痹病（ CBP） 、蜜蜂急性麻痹病（ ABP）等给养蜂业造成了很大损失SB 有两种：一种是西方蜜蜂的囊状幼虫病，一种是东方蜜蜂的囊状幼虫病CBP 是一种常见的西方蜜蜂成年蜂病，在世界各地广泛发生，在我国是春秋二季蜜蜂死亡的主要原因之一ABP 为西方蜜蜂的一种成年蜂病害，首次在英国发现，我国也有发生HBP 又称“死蛹病” ，为蜜蜂蛹期的一种病毒病，目前仅有我国报道发生该病除此之外，一些对养蜂业危害严重蜂病毒病如黑蜂王台病毒病（BQCV） 、克什米尔病毒病（KBVD）和残翅病毒病（DWV）等，虽然在我国还没有报道，但当今国际间的频繁的蜂及其产品贸易往来、人员往来等原因，使得一些未在我国发现的病毒病对我国养蜂业构成了潜在的威胁，特别是近年蜂病发生，不再是单感染，更多是混合感染，使得蜂病毒病危害日趋严重。

2Baker 等在对英国德文郡的 23 个蜂场的 6 种病毒调查表明，97%蜂群的残翅病毒检测为阳性，急性麻痹病毒阳性率为 29%，囊状幼虫病和黑蜂王台病阳性率是 1.4%，且混合感染在蜂群中是普遍存在，一种以上病毒感染的阳性率是 32%［1］ Antúnez K 对乌拉圭各省份蜂群除 KBV 外的剩下的 5 种主要蜂病毒感染情况进行了调查，获得类似结果，病毒的混合感染情况普遍存在，且被检测的样品 96%都感染一种或一种以上病毒［2］ 本文将对病毒病的病原、流行病学和免疫防御作一介绍1 病毒基因组结构除了丝状病毒和彩虹病毒外，目前发现的蜂病毒均为单链 RNA病毒，二十面体球型结构，没有囊膜，60 个拷贝的 VP1、VP2 和VP3 三个亚蛋白构成衣壳，有的病毒除了上述三个亚蛋白外，还有一个小的蛋白 VP4，比如 CSBV、BQCV 和 ABPV 等大部分蜂病毒基因组结构都具有共同的特征，(1)均为单链 RNA病毒，并被衣壳包裹；（2）在基因组 5’端有一个小的 VPg 蛋白，VPg 蛋白具有稳定基因组 5’端结构、启动翻译和复制功能；（3）在 5’非编码区有四叶苜蓿形的二级结构，推测可能与蛋白翻译有关；（4）3’polyA 尾巴在不同病毒长度不同，但具有遗传稳定性；（5）基因组 3’端序列能折叠成颈环结构，推测可能与 RNA 复制3有关。

目前已完成了 SBV、ABPV、BQCV、KBV、KV 和 DWV［3-5］ 6 个病毒的全基因组测序，CBPV［6］ 部分基因组测序除3’polyA 外，蜂病毒全基因长大约 8550 bp～10140 bp，基因组富含 AU 碱基，GC 含量 37.6-40.71%SBV、DWV 和 KV 基因编码一个大的阅读框，ABPV、BQCV 和 KBV 编码两个不重叠的阅读框，两个阅读框间有一非编码的插入序列（IGR ） 在 5’非编码区和 IGR 区都有核糖体结合位点（IRES） ，具有启动病毒蛋白的翻译功能，但两个 IRES 序列和翻译启动机制不同根据蛋白的基因组成顺序，蜂病毒基因组可分为两类，ABPV、BQCV 和 KBV 的结构蛋白在近 3’端编码，非结构蛋白在近 5’端编码，相反 SBV、DWV和 KV 的结构蛋白在近 5’端编码，非结构蛋白在近 3’端编码，为此 ABPV、BQCV 和 KBV 被称为昆虫类 RNA 病毒，属于Cripavirus 属，dicistroviridae 科，SBV 和 DWV 属于 Iflavirus 属，但还没有分科遗传进化分析表明，ABPV、BQCV 和 KBV 属于一个分支，KBV与 ABPV 遗传关系最近，BQBV 与 KBV 和 ABPV 趋于一个分支，但他们之间遗传进化关系并不十分近。

SBV、DWV 和 KV 遗传关系较近，同属于一个群42 蜂病毒传播方式2.1 水平传播蜜蜂的许多行为如哺育幼虫，护理蜂王、储存花粉、酿造蜂蜜以及蜂巢清理等蜂群的高密度的群体生活，群体成员频繁接触等，都会增加病毒的水平传播机会Chen［7，8］等先后在蜂蜜样品和蜂王的肠道内检测到 DWV 和 BQCV，Shen ［9 ］等从各个发育阶段的蜜蜂体内和蜜蜂食物包括幼虫食物、蜂蜜、花粉和王浆中都检测出了 KBV 和 SBV，Hung 等［10］采用 R T — P C R 技术从工蜂和蜂王的粪便中检出 KBV，这些为蜂群中存在通过食物传染病毒的水平传播途径提供了证据此外，狄氏瓦螨是许多病原的携带者和传播者Chantawannakul［11-12］等用定量 PCR 技术，第一次报道了绝大多数瓦螨身上携带有 KBV、APV 、DWV、SBV 和 BQCVShen 等研究发现蜜蜂的病毒病有多种原因引起的，从蜂螨身上和唾液中分离到了 KBV 和 SBV，蜂螨可能是蜜蜂病毒病的携带者和传播者2.2 垂直传播Fries 等［13］基于蜂病的模式，首次提出了病毒的垂直传播途5径，但是由于病毒感性阴性蜂王以及多种病毒感染密蜂等原因，很难通过接种蜂王来验证蜂病毒垂直传播途径。

Chen［14］等利用RT-PCR 检测方法对 10 个蜂群的蜂王的血淋巴、卵巢、肠、头等器官组织的 SBV、CBPV、ABPV、BQCV、KBVD 和 DWV 感染情况进行检测，除了 ABPV 没有检测到外，其他 5 种病毒在蜂王的一个组织或多个组织检测到，其中蜂王的卵巢中，100%检测到DWV、40%检测到 SBV，表明蜂病毒病垂直传播的可能性为了更进一步证明病毒的垂直传播方式，Chen 等检测了经表面消毒处理的卵和蜂王卵巢的病毒情况结果在表面消毒处理的卵里检出病毒， 排除经卵表传递的可能性，证明存在经卵巢传递途径这进一步表明病毒从蜂王向其后代垂直传递的可能性很大另外，从雄蜂精液中检出蜜蜂病毒，可作为通过雄蜂垂直传递病毒的一个证据只是该研究并未能证明所检出的蜜蜂病毒是来自精子， 否则就更有说服力3 蜜蜂抗病毒免疫特点3.1 群水平防御蜜蜂对侵入者的免疫构成不仅包括由免疫相关基因调控个体防御，也包括群水平防御机制与其它的非群居昆虫比较，蜜蜂免疫相关6基因的减少可能是群水平防御加强的结果卫生学的行为是以工蜂快速发现病死蜂窝、打开蜂窝的盖、并消除受到侵袭的蜂窝工蜂的这种卫生学行为是蜜蜂免疫的一个重要方面，研究表明可有效地防御美洲腐蛆病、白垩幼虫病、群中瓦螨属壁虱［15］ 。

另有研究表明，卫生学活动是蜜蜂中抗病毒感染的有效防御策略人们观察到蜜蜂对热敏感病原 Ascosphaera apis 侵入做出的反应是在幼虫未被杀死之前产生蜂窝热这种产热行为是蜜蜂所展示出来的一种特殊的群居防御策略此外，蜜蜂通过在蜂房产物中产生抗微生物的物质来提高对疾病感染的抵抗力蜂胶已被鉴定出富含一组生物活性抗氧化剂黄酮类物质，可以促进天然免疫和细胞研究表明蜂胶不仅有粘合剂的蜜蜂蜂巢裂痕的功能，而且具有抵抗微生物的特性，有助于阻断病毒、细菌、和其它微生物侵入蜂房蜜蜂天然防御的另外一个特征是蜂群食物抗微生物活性，包括蜂蜜、花粉和蜂王浆抗生物质（也成为“抑制素” ）抑制储藏食物中细菌和真菌的发育葡萄糖氧化酶是一种对昆虫病原有抗微生物活性的酶葡萄糖蛋白酶在蜜蜂咽上沟腺内特异性表达并分泌到蜂王浆中，保护蜂巢免受微生物感染［16］ 7尽管有蜂群食物抗细菌和真菌感染特性的记载，但还没有蜂群食物抗病毒活性的报道蜂王浆中表现出有抵抗柯萨奇病毒 B(微小RNA 病毒的一种) 的新蝶呤的鉴定，意味着蜂群食物可能具有抗病毒效果［17］ 将来对来自蜜蜂和蜂群食物中抗病毒物质的鉴定和描述会给蜜蜂病毒疾病的治疗做出重大的贡献。

3.2 个体水平防御3.2.1 物理与化学屏障蜜蜂病毒通常在蜜蜂进食或发生体表创伤时经消化道进入到宿主体内，然而它们也可以经由瓦螨属或其它昆虫的叮咬直接进入血液循环像其它昆虫一样，蜜蜂能够利用物理与化学屏障作为避免感染的被动防御的一条最初防线物理与化学屏障都为非特异性免疫物理屏障包括角质层外骨骼、气管壳质的内层、前肠后肠的角质内层以及中肠的围食膜坚硬的表皮角质层从物理上将内部组织与外部环境分离，从而防止了微生物的侵入围食膜、中肠的壳质的基质内层构成了保护内部组织的第二界面,同时作为通透性屏障防止随食物进入消化道的病原经肠壁进入血管体腔另外，肠道的生化环境能形成一道化学屏障抑制病原的繁殖和传播到其它组织3.2.2 细胞免疫反应8尽管物理及化学屏障通常可以防止病原进入机体，但病原偶尔也会突破这些防线并开始繁殖一旦物理与化学屏障被攻破，蜜蜂就会通过第二道防线先天免疫反应保护自己免受感染，即通过吞噬作用、小丘的生成、包囊作用、黑化作用等清除病原微生物吞噬作用是血细胞对较小微生物如细菌作出的主要反应它包含血球蛋白与细菌或真菌的多糖结合、血细胞数量和形态变化以及细胞内杀灭病原小丘的生成是多个血细胞合作的细胞免疫反应，血细胞可以将大量细菌聚集在血细胞凝聚物（小丘）上。

小丘生成是血淋巴中清理大量微生物的一个重要的机制当侵入者体积太大而不能被吞噬或者也不能形成小丘，它就会被一个囊状的膜包裹起来，这个膜由多层血细胞或一层黑色素膜组成，或由两者共同组成包囊作用为抵御如寄生虫样的较大的入侵者时的最有效的细胞介导的免疫机制血细胞介导的杀伤机制经常由酚氧化酶效能和黑化作用来完成酚氧化酶级联反应的激活触发了黑化反应一个关键的酶―酚氧化酶能将酚转化为奎宁，随后聚合成黑色素在更多血细胞未招来之前，黑色素被沉积到入侵者的周围，致使黑化细胞膜盒的最后形成，并伴随有宿主体内氧化亚氮、超氧化物以及过氧化氢水平升高然而，有另一种包囊作用，细胞包囊作用，不依赖于氧气并且没有任何黑化作用即可发生细胞包囊的杀伤作用可能依赖于溶菌酶的水解机制［18］ 9蜜蜂体内对于真菌感染免疫表现了细胞介导的免疫反应特征酚氧化酶与葡萄糖脱氢酶存在于蜜蜂的血淋巴中［19］ ，在黑色素合成过程中起重要的作用，在防御入侵微生物与寄生虫过程中具有重要的作用此外编码参与 PAMPs 与 PGRPs 和 GNBPs 的结合的丝氨酸蛋白酶与丝氨酸蛋白酶抑制剂的基因已经在蜜蜂的基因组中被鉴定出来，说明蜜蜂拥有先天免疫系统，这个系统使蜜蜂能够抵御各种微生物和寄生虫［20］ 。

然而，蜜蜂如何通过细胞介导的防御反应来抗病毒感染仍不明确3.2.3 体液免疫反应对于昆虫体液免疫知识大部分来源于果蝇的研究，迄今为止，在果蝇体内已经鉴定出数种抗微生物肽，抗微生物肽进入血淋巴，在免疫系统受到攻击时作出反应研究发现，抗微生物肽的表达是由两个 NF-κB 信号传导途径， Toll 途径以及免疫缺陷途径进行调控［21,22］ 体液信号途径也是由 PAMPs 与 PGRPs 和 GNBPs 的结合所触发，与上游感染识别有关Toll 途径在革兰阳性细菌和真菌感染过程中是一个关键的信号传导途径Dostert 等的研究清楚地表明防御细菌和真菌感染除了 Toll 途径和 Imd 途径，另一个进化保守先天免疫途径——Jak-STAT 途径存在于果蝇体内并参与抗病毒感染果蝇研究产生的数据表明昆虫具有有效的先天免疫系统，不10仅能够对细菌和真菌的感染作出反应，而且能对病毒感染作出反应果蝇的抗病毒免疫的知识应该在蜜蜂病毒感染与宿主免疫反应之间关系上给我们很大的启发昆虫体液免疫反应包含脂肪体（功能上相当哺乳动物的肝脏）分泌抗微生物肽4 展 望近几年，对蜂病毒虽然进行了广泛的研究，却没有从分子水平对蜂病毒的特性的进行全面的阐述，比如病毒传播过程中的调控机制是什么？病毒基因表达对致病机理影响如何？宿主的免疫调控对病。