蛋白提取及WB步骤.doc

Western blot 实验1) 蛋白裂解液的配制：Urea (7 M) 4.2 g, Thiourea (2 M) 1.52 g, CHAPS (4% W/V) 0.4 g, DTT (1% W/V) 0.1 g, ddH2O加至10 ml, 1 ml/管分装-20C保存备用；1 ml分装的 裂解液中用前加入 Cocktail( 1% V/V) 10 pl，混匀后于冰上放置备用我们用的是国产的碧云天的全蛋白提取试剂盒2) 蛋白样品制备(1) 取组织，称重，按照 W:V = 1:6的比例加入蛋白裂解液；(2) 用匀浆器对组织进行匀浆，匀成糊状3) 4 °C,冰上放置30mi n,每10 min振荡一次；(4) 4 C, 12000 g离心30 min,吸上清，分装置于-70 C待用3) 蛋白浓度测定(Bradford法)试剂配制：考马斯亮蓝染色液：考马斯亮蓝G250 0.05 g, 95%乙醇25 ml ,出卩4 50 ml, ddH2O加至500 ml,过滤后储存于4 C牛血清白蛋白(BSA): 1 mg/ml步骤：按下列体系配置溶液，混匀后，静置5 min后，测OD值(波长595 nm),将OD值输入Excel进行数据处理，计算出相关系数，当相关系数 >0.99才具有可信度。

取待测标本，正确设置 reference,取适量标本，进行浓度测疋管号BSA (1 mg/ml)0.9% NaCl/0.1 M PBS考染液00200 p1 ml15195 p1 ml210190 p1 ml315185 p1 ml420180 p1 ml525175 p1 ml我们用的是国产碧云天的BCAS白浓度测定试剂盒4) 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)(1) 凝胶制备：30.8%丙烯酰胺：丙烯酰胺30 g,甲叉双丙烯酰胺0.8 g,ddH2O加至100 ml, 置于通风橱内搅拌直至丙烯酰胺完全溶解，用0.45 ym微孔滤膜过滤后4 C保存 于棕色瓶中备用1.5M Tris (pH8.8)： Tris 18.17 g, HCI 调至 pH8.8, ddHzO 至 100 ml;经验配制：配制1.5 M Tris ( pH8.8)500 ml时直接加入10 M HCI (即HCI 原液)15 ml，不用再调pH0.5M Tris( pH6.8)： Tris 6.057 g, ddH2O 加至 100 ml，HCI 调至 pH 6.810%SDS: SDS 1 g, ddHzO 加至 10 ml。

10%过硫酸铵：过硫酸铵 0.1 g，ddH2O加至1 ml电泳缓冲液：Tris 3.02 g,甘氨酸 14.4 g, SDS 1 g, ddHzO 加至 1000 ml转膜缓冲液：Tris (15.6 mM)1.93 g,甘氨酸(120 mM)9 g, ddH2O 至 1000 ml 凝胶制备:成分12%分离胶(5 ml)5%浓缩胶(4 ml)30.8%丙烯酰胺2.0 ml0.67 ml1.5M Tris (pH8.8)1.3 ml--0.5M Tris (pH6.8)--0.5 ml10%过硫酸铵0.05 ml0.04 ml10%SDS0.05 ml0.04 mlTEMED0.002 ml0.004 mlH2O1.6 ml2.7 ml步骤：将电泳槽装置安装好，根据需要量配置分离胶，灌注，用饱和正丁醇 封液面，室温30 min~60 min待胶凝固后，去除正丁醇，配制浓缩胶，灌注，将 加样梳放入，室温30 min~60 min待胶凝固后即可上样电泳；(2) 上样：将蛋白质标本中加入 2XLoading Buffer [0.2% (g/v) bromophenol blue, 4% (g/v) SDS, 20% glycerol, 200 mM 2-mercaptoethanol ( DTT) , 100 mM Tris (pH 6.8)],煮沸 5 min~10 min , 12000 rpm离心后加样；(3) 电泳：浓缩胶10 mA恒流电泳至交界处，分离胶20 mA恒流电泳至溴 酚蓝到达凝胶下缘，可根据蛋白分子量的大小确定电泳的位置；我们是bioworld的机子，一般可以电泳用恒压 80V跑到底。

5) Western blot分析(1) 半干转膜仪转膜(具体和实验室机子有关)：剪与凝胶大小一致的PVDF 膜一张(膜用之前的处理：甲醇浸泡 min,ddH20浸泡5min，然后和滤纸一起泡 到转缓里)，滤纸12张，浸泡于转膜缓冲液中至少20 min,先将滤纸逐层置于转 膜仪上，用下胶尺逐层赶尽气泡，加上 PVDF膜，赶尽膜与滤纸间的气泡，将聚 丙烯酰胺凝胶放在PVDF膜上，赶尽凝胶与尼膜之间的气泡，逐层加上滤纸，要 尽量排放整齐；按照0.8 mA/cm2~1 mA/cm2的功率恒流转膜2 h~2.5 h注意正负 极我们一般用的是250ma转两个小时2) 将PVDF膜放入含5%脱脂奶粉的TBS中封闭2 h;(3) 加入5%脱脂奶粉稀释的一抗，4 °C过夜；(4) 次日用TBS洗3次，每次10 min;(5) 加入HRP结合的二抗，37 C，1 h;(6) TBS 洗 4 次，每次 10 min；(7) 显影：这个是根据各个实验室的设备。