水飞蓟发状根培养体系的建立及其水飞蓟宾含量的测定.doc

水飞蓟发状根培养体系的建立及其水飞蓟宾含量的测定［摘要］实验采用6种发根农杆菌R1601, R15834, R1000, A4, R1025, R1感染水飞蓟植体，诱导水飞蓟发状根及其水飞蓟宾的产生6种发根农 杆菌均能诱导水飞蓟产生发状根，A4表现出较强的对水飞蓟的感染能力 实验通过侵染时间、预培养、共培养、pH等因素确定了诱导水飞蓟发状根 产牛的条件，确定MS液体培养基适合水飞蓟发状根的增殖经过PCR分 子鉴定，发根农杆菌中的DNA质粒成功的整合到转化根的基因组中使用 液相色谱测定了水飞蓟发状根中水飞蓟宾含量是水飞蓟植物中的2. 5倍 实验所建立的水飞蓟发状根培养系统，为研究水飞蓟发状根大量培养生产 水飞蓟宾奠定了基础［关键词］水飞蓟；发根农杆菌；发状根；水飞蓟宾［收稿日期］2013-11-13［通信作者］杨世海，Tel: ( 0431 ) 84533086 , E-mail :jlyangs@163・ com［作者简介］张淑丽，硕士研究生，E-mail： littlepighappy@. com 水飞蓟Silybum marianum (L. ) Gaertn别名水飞雉、乳蓟、老鼠 筋、如蓟子，原产于南欧及北非，属于菊科水飞蓟属植物，干燥成熟的果 实入药。

瘦果呈长倒卵形或椭圆形，长5〜7 mm,宽2〜3 mm表面淡灰棕色至黑褐色，光滑，有细纵花纹；顶端钝圆，稍宽，有一圆环；中间具 点状花柱残迹；基部略窄，质坚硬破开后可见子叶2片，浅黄白色，富 油性，气微，味淡［1］水飞蓟种子和水飞蓟植物中含有水飞蓟素，水飞 蓟素具有抗肝中毒、保护肝细胞膜、改善肝功能的药理活性，临床用于治 疗肝炎、胆囊炎等［2］,主要成分为水飞蓟宾近年来水飞蓟素乂扩展应 用到抗衰老和美容化妆品领域［3］；随着研究的深入，水飞蓟素在癌症的 治疗中也发挥着越来越重要的作用［4-5］,市场需求巨大利用发根农杆菌Agrobacterium rhizogenes诱导药用植物产生发状 根，寻求建立适合牛产次牛代谢产物的培养系统，已成为药用植物培养系 统的一个研究热点与传统的细胞培养技术相比，发状根具有遗传稳定、 生长迅速、合成次生代谢物质能力强且稳定及向培养液释放部分代谢产物 等优点，是生产次生代谢产物较理想的组织［6］本研究利用发根农杆菌R160I, R15834, R1000, A4, R1025, R1诱导 水飞蓟组织产生发状根，建立水飞蓟发状根离体生长的培养体系，为发酵 法扩人培养提供可行性动力学参数，同时也为药用植物水飞蓟提供一条可 持续性利用的新途径。

1材料与方法1.1水飞蓟无菌苗的培养供试水飞蓟S. marianuin种了采自吉林农业大学药植园，经吉林农业 人学中药材学院杨世海教授鉴定挑选当年成熟干燥的水飞蓟种子，温水 浸泡60 min后，在生物洁净工作台内用无菌水清洗3次；75%乙醇浸泡30 s,无菌水清洗3遍，每次清洗30 s；然后再用0. 1% HgC12浸泡10 min ,无菌水再次清洗5~6次，每次清洗2〜3 mine最后用灭菌滤纸将种子表 面的水分吸干，用银子轻轻放置在装有MS固体培养基（不添加任何激素） 中，置于温度为24〜25 °C、光强2 000 lx、光照12h?d-1、黑暗12 h?d-l 的条件下交替培养，等待萌发无菌水飞蓟幼苗，作为遗传转化用的外植体1.2发根农杆菌的活化发根农杆菌菌株 Agrobacterium rhizogenes R1601, R15834, R1000, A4, R1025, R1,由中国农业微生物研究所菌种保藏中心提供在无菌条 件下，用接种针挑取保存菌液，于YEB固体平板上划线培养，放置于28 °C 暗培养条件下培养，直到长出单菌落挑取1个单克隆菌落接种于装有加 有Kan的20 mL YEB液体培养基中,28 °C恒温摇床,180 r?min-l条件下 培养24 h,将农杆菌复苏。

将已复苏的菌液取出1 mL加入装有50 mL YEB 液体培养基的锥形瓶中，恒温摇床28 °C, 180 r?min-l再次培养12 h, A600为0.4时进行侵染1.3水飞蓟发状根的诱导在无菌条件下将水飞蓟无菌苗的幼嫩叶片剪成0. 5 cm2大小的片段， 根、茎段、叶片分别剪成长约0.5 cm和0.5 cm2的小段和叶丿仁 每个样 品在MS0 （不添加任何激索）固体培养基上接种10片（段），并且每个样 品均做3次平行，黑暗中26 °C下预培养36 h在超净工作台内，将预培 养的外植体（根段、茎段、叶片）转移至活化好的发根农杆菌菌液中，侵 染在侵染过程中，轻轻地摇晃锥形瓶，4 min后用无菌滤纸吸干表面菌 液，接种到固体培养基上，在24 °C黑暗条件下共培养12 h,转接到含有 500 mg?L~l Cef的MS （不添加任何激索）固体培养基上于26 °C黑暗条件下培养，同时以未被菌液感染的外植体作为对照每1 d转接1次，待长 出发根后，逐步降低抗生索浓度，及时转移和扩增在无激素MS培养基上, 多次继代直至达到完全除菌后再去掉抗生素继续培养21 d后统计诱导出 的发状根数，并且计算平均诱导率。

发状根诱导率二长出发状根的外植体数/接种外植体的总数XI00%1.4 PCR分子鉴定虽然可以根据发状根形态学上的特点（生长无向地性等）对其进行判 断，但是这种判断可信度不高，所以得用卩CR对成功诱导出来的水飞蓟片 转化根进行验证，来确定转化是否成功在PCR扩增试验中，阳性对照为 菌株A4的质粒DNA扩增产物，阴性对照为未转化植株DNA扩增产物，设 计并合成扩增rolB的PCR引物，上游引物5 z - CTCCTGACATCAAACTCGTC-3',下游引物 5’ - TGCTTCGAGTTATGGGTACA-3' 反应条件 95 °C 1 min； 94 °C 30 s, 50 °C 30 s, 72 °C 1 min, 35 个 循环；72 °C 7 min,保存4 °C ［7］ 1.5水飞蓟发状根增殖液体培养基的筛选在无菌条件下将假酸浆在固体培养基中长出分枝多且长的发状根剪 下，分别放入到MS, 1/2MS, Wh讥e, R2的液体培养基中开始进行增殖培 养，培养液20 mL装在（50讥三角瓶），称取约为0. 15 g鲜重接放入每 瓶培养液中，在温度为28 °C,转速为120 r?min-l的摇床中暗培养，依 次平行重复做3次，对三角瓶中发状根增殖情况进行持续观察，最终筛选 出最为适合水飞蓟发状根增值的液体培养基。

1.6水飞蓟发状根中水飞蓟宾含量的测定参照文献［1］的方法进行色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基 硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水-冰醋酸（48 ： 52 ： 1）为流动相；检 测波长为287 nmo对照品溶液的制备：取水飞蓟宾对照品（曼斯特生物制 品有限公司）适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含0.12 mg的溶液， 即得供试品溶液的制备：取干燥的种皮、植物和发根粉末（过3号筛） 各0.5 g,精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75%甲醇50 mL,称重， 加热冋流30 min,放冷，再称重，用75%甲醇补足失重，摇匀，静置，取 上清液，即得测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5 UL, 注入液相色谱仪，测定，以水飞蓟宾2个峰面积Z和计算，即得2结果与分析2.1种子灭菌方法用10%双氧水和0. 1%, 0.2%升汞灭菌，将种子接种到MS基本培养基, 3 d后，见表1从表1中分析可知，10%双氧水，消毒时间为2, 4 min时，污染率显 著性差异，6, 8, 10, 12 min时有显著性差异；发芽率在不同的消毒时间 有显著性差异；二者比值处理时间为2, 4 min时无显著性差异，6, 8 min 时无显著性差异。

0.1%升汞：污染率和发芽率在不同的消毒时间，存在显 著性差异，比值在2, 4, 6, 8, 10 min存在差异，而10, 12 min无差异 0.2%升汞：污染率、发芽率和二者比值在不同的消毒时间都存在差异3 种处理中，0.1%升汞处理10 min,发芽率为81.00%,污染率13. 27%,二 者比值为0.17,差异显著（P〈0・05）为最佳处理实验发现，水飞蓟种子 主要为种皮内部菌，所以在选用0.1%消毒10 min后，将种子接入MS培养基中，萌发后，去掉种皮，这样可进一步降低污染率2. 2发根农杆菌菌株和外植体对水飞蓟发状根诱导率的影响利用R15834, R1601, R1000, A4, 1025, R1 6种发根农杆菌釆用共 培养法对水飞蓟的不同外植体（根、叶片、茎段）进行诱导，以未被任何 菌株感染的外植体空白対照组，见图1从图1中不同菌种的诱导率情况可以看出，R1601和R15834的菌株对 水飞蓟的叶片的诱导率都为0,可能是这2种菌株对其叶片没有诱导能力 R1和R1025对茎段的诱导率都为0,可能是该菌种对水飞蓟叶片和茎段没 有诱导能力R1000仅对水飞蓟的根诱导成功。

A4水飞蓟外植体根、茎、 叶都成功诱导出发状根，对根段的诱导率最高84. 83%,差异显著（1X0. 05）o 而菌株R1025, R1601, R15834, R1000, R1对根段的诱导率分别为50%, 75%, 70%, 50%, 55%o因此A4是诱导水飞蓟的最佳菌种，最佳外植体是 根段（因此后续试验均采用A4菌种侵染根段），诱导出的发状根见图22.3不同侵染时间对水飞蓟发状根诱导率的影响适宜的侵染时间有助丁发根农杆菌对植物细胞的附着和转化侵染时 间的长短与诱导率的高低有着直接联系如果侵染时间过短，发根农杆菌 无法及时侵染植物细胞；侵染时间过长则菌株对植物细胞造成无法恢复的 损害，致使外植体无法存活采用共培养方法，用发根农杆菌A4分别侵 染水飞蓟一定量的根段0, 2, 4, 6, 8, 10 min, 21 d后计算诱导率不 同侵染时间対发根诱导率的影响特别明显随着侵染时间的增加，诱导率 也随之升高，侵染4 min后诱导率开始下降，在8 min之后并且杂菌大量 生长，外植体软腐，部分死亡，10 min之后外植体全部死亡因此，侵染时间4 min为宜，见图32. 4外植体预培养和共培养时间对水飞蓟发状根诱导率的影响2.4.1预培养时间外植体产生伤口后，在愈合过程中会形成并释放 出乙酰丁香酮等酚类物质，以此作为诱导发根农杆菌识别的信号分了。

发 根农杆菌侵染前需经过一定时间预培养，使受体能形成并释放这种信号分 子，从而提高转化率另外，经农杆菌感染的外植体伤口处细胞可能因为 过敏反应而褐化，甚至死亡，会严重影响转化效率及发状根的形成，预培 养也能较好地解决褐化问题木实验对水飞蓟根段分别进行0, 12, 24, 36, 48, 60 h的预培养，然后分别用发根农杆菌A4进行侵染，3 d后观 察其转化结果，见图4由图4数据可以看出，水飞蓟根段经过不同的预培养时间培养后，转 化率有所不同36 h前，诱导率随着预培养时间的增加而增加，但48 h 后，诱导率随预陪养时间的增加而减小由此可以得出，36h是水飞蓟根 段的最佳预培养时间2.4.2共培养时间共培养是农杆菌将其携带的外源基因向外植体转 化的过程，适当的共培养时间是农杆菌能否将外源基因成功转化的关键 共培养时间的长短与转化效率密切相关，时间太短，农杆菌來不及把基因 片段整合到植物DNA上但共培养时间过长，可使发根农杆菌过度生长， 而严重毒害外植体使转化难以实现本实验对水飞蓟分别进行0, 12, 24, 36, 48, 60 h共培养的观察，共培养12 h诱导率最高，而24 h后随共培 养时间的增加而减少，见图4。

如图4所示，在预配养为36 h时，诱导率可达到84. 67%；共培。