成年小鼠心脏灌流.doc

成年小鼠心脏灌流实验材料：需要观察脑切片的小鼠试剂/试剂盒:乙醚；生理盐水（3７℃水浴);4％ＰＦA;30％蔗糖仪器:蠕动泵；剪刀；镊子；针头;导管实验步骤:1、准备实验器材:两个锥形瓶(1个装生理盐水，一个装4%多聚甲醛,记得要用封口膜封口)2、用生理盐水冲洗导管,并排除管内气体灌流时选用雄性动物比选用雌性动物要好,原因是雌性动物受其激素周期影响，雄性的结果更为可靠）3、在密闭容器内加适量乙醚,麻醉小鼠需要注意的是，小鼠清醒一点比死掉要好，防止血液凝固给灌流带来阻力)4、待小鼠麻醉后立即将其用针头固定在泡沫板上（用针头插住四肢)5、一只手用镊子扯起胸部皮肤，另一只手用剪刀剪开胸腔的皮肤和肋骨,暴露出心脏和肝脏６、将注射针头插入小鼠左心室(如针头不稳可用镊子将其固定在泡沫板上），同时将小鼠肝脏减掉，以使血液流出灌流速度5.8rpｍ灌注生理盐水的时间维持在10min左右，血液排除后四肢、肝脏和舌头会变白）7、对小鼠进行剪尾取样，以备测定其基因型同时,将小鼠信息卡片上记录灌流信息,并将灌流小鼠的信息记录在自己的实验记录本上,以方便后续的重新基因型鉴定操作8、待小鼠四肢、肝脏和舌头变白之后，将导管始端从生理盐水中拿出,将其放入冰浴的4%ＰFA溶液（４℃）中,用4%PFA灌流固定时,当PFA流至大脑处可能会使小鼠尾巴略有反射现象(有时可能没有),此时可将灌流速度由5.８rpｍ调至4.８rpm,以使固定更加充分。

整个ＰＦA灌流时间约为20miｎ固定原理:多聚甲醛可以使蛋白质交联）9、将导管始端从PＦＡ中拿出,待管中液体流尽后,将心脏上的针头拔下，如果固定的较好，可发现小鼠眼球呈现白色将托盘中的血液倒至废液桶内,并准备下一步的取脑操作１0、拿出一条纸巾，将小鼠尸体放在上面，沿颈部剪下头颅1１、剪开头部皮肤，露出白色头盖骨将延髓上包被的软骨剪开,除去多余的结缔组织需要注意的时,眼睛要由剪刀剪下,不能够直接扯下来,因为眼睛后部连着视神经,如果扯的话有可能会损坏视交叉上核等其他脑部组织１2、将头盖骨小心剥开，露出白色的脑部,在剥嗅球部位时要格外小心，必要的话可以先将嗅球前部的碎骨留着待进一步固定之后再去除13、将头盖骨剥开后,将脑下部连接的神经逐条剪短（可看到视神经交叉）,待全部剪断后将脑整个剥离出来14,将剥离出来的脑浸泡在4％PFＡ中,过夜固定１5、将ＰFA液换为30%蔗糖进行脱水（防止冷冻切片时形成冰晶和孔洞)，初始脱水时脑会浮在蔗糖上面,待完全脱水后脑会沉底此时可将脑取出进行冷冻切片内容总结ﻭﻪ(1）成年小鼠心脏灌流ﻭﻭ实验材料:需要观察脑切片的小鼠ﻭ试剂/试剂盒：乙醚ﻭﻪ(2）成年小鼠心脏灌流实验材料:需要观察脑切片的小鼠ﻭ试剂／试剂盒：乙醚ﻭ（３）５、一只手用镊子扯起胸部皮肤,另一只手用剪刀剪开胸腔的皮肤和肋骨,暴露出心脏和肝脏ﻭﻪ（4)将托盘中的血液倒至废液桶内,并准备下一步的取脑操作（5)将延髓上包被的软骨剪开，除去多余的结缔组织（６）此时可将脑取出进行冷冻切片。