细胞筛选 一 嘌呤霉素.docx

细胞筛选 一 嘌呤霉素（一） 确定最优筛选浓度 当用于筛选特定细胞的嘌呤霉素合适浓度未知时，需进行滴定， 或制定针对那种细胞的嘌呤霉素杀菌曲线一般而言，嘌呤霉素浓度范围在2-10 微克/毫升 时是足以杀灭大多数未转染的哺乳动物细胞系 1. 培养待转染（而不是转染后）的细胞 （筛选的目的是杀灭未转染的细胞） 2. 取对数生长期的细胞（一般在铺满培养器皿底部的 70%~80%时），用新鲜无抗无血清的培养基制成1.5X105个/ml的细胞悬液3.向96 孔培养板中加细胞悬液，每孔100微升（使每孔细胞数在1.5X104个），然后向每孔加新鲜 无抗无血 清的培养基适量，培养箱中静置培养过夜这样做是为了保证在固定细胞密度下 确定最佳G418药物筛选浓度4.第二天用嘌吟霉素浓度分别为0, 2, 4, 6, 8, 10微克/毫 升的新鲜无抗无血清培养基溶液替换各孔中的旧的培 养基每个浓度可用两个复孔，相当 于每个浓度测定三次）注意：对于多数细胞种类而言，过量的嘌吟霉素能引起许多非必需 的表型的反应 5. 每日检查细胞活力，根据细胞活力，每三天（ 即每隔两天）更换含嘌吟 霉素的新鲜无抗无血清培养基溶液一 次。

如细胞生长过快，可以缩短换液时间（每隔一天）6. 在正常的实验操作规程时 ，一种细胞最优筛选浓度的确立时间随细胞的生长率和一般生 存时间而定，大 概需3到14天在所需时间之后，嘌吟霉素的导致所有细胞死亡的最小浓 度就是应该用于该细胞和该实验的浓度最优浓度为在3-5天内杀死所有细胞的浓度二）转染细胞1.第一天：在60mm培养皿内种植细胞，细胞密度为能使第二天细胞融合 能达到70%-80%的密度，CO2孵箱 过夜培养2.第二天：准备3ml无抗生素无血清培养 基，加入Polybrene使其终浓度为8ug/ml将已经制备的病毒颗粒0.5 ml加至上述培养基， 轻吹混匀去除60mm培养皿内的旧的培养基，加入含病毒培养基Polybrene能够增加病 毒感染的效率，然而，有时候Polybrene对细胞有毒性这时，可以用Protamine Sulfate代 替 Polybrene）（三）筛选细胞1.病毒感染后24小时，可以换用含最优浓度puromycin的培养基2.如 果病毒对细胞有毒性，可以减少感染时间至4-6小时，然后换用新鲜培养基， 24-48小时后 换加含最优 浓度puromycin的培养基最好设立一个对照皿，不加病毒液，加入Ploybrene， 观察Polybrene是否对细胞有毒性；如果Polybrene没有毒性，还可以加入puromycin，作为 puromycin是否有效的对照。

3.以后每隔一天换用新鲜含puromycin的无抗生素无血清培 养基，以替换含大量死细胞的培养基直到抗性 群落能被识别出（一般是在筛选后 10 到 12天）4.待抗性细胞长满以后，细胞转入10cm培养皿，同时，留一部分细胞在原来的 60mm平皿内5. 60mm平皿内细胞长满后，收获细胞，在蛋白或mRNA水平鉴定基因敲 低效率 6. 10cm 培养皿内的细胞待长满后传代，首先每种稳定细胞系冻存4-5 支细胞， 待基因敲低鉴定清楚后，解冻 冻存细胞，进行表型观察分析通常情况下，由于慢病毒为 复制缺陷型病毒，受感染的细胞不能产生新的病毒，因此从加入病毒颗粒开始，经过5-6次 换液后，培养基内已不存在病毒颗粒，可以移至普通细胞培养室内培养研究二 G418 （ 一） 确定最优筛选浓度 由于每种细胞对 G418 的敏感性不同，而且不同的厂 家生产的相同浓度的G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛 选浓度1. G418的配制：取1g G418溶于1ml 1mol/L的HEPES液，加蒸馏水定容至10ml（使G418终浓度为0.1g/ml ,HEPES终浓度为100mmol/L）,过滤消毒，4度保存。

HEPES 的化学全称为羟乙基呱嗪乙硫磺酸（N‘ -a-hydroxythylpiperazineN' - ethanesulfanic acid ）， 分子量238.31，是一种氢离子缓冲剂，能较长时间的控制溶液的pH处于恒定的范围，而对 细胞无毒性作用1mol/L HEPES的简单配置：HEPES 23. 83g，溶解于80ml的双蒸水中， 用10mol/L的NaOH调节pH至7.2-7.4，定容至100ml，0.22um小滤器过滤HEPES使用终 浓度为10-50mmol/L2.制备筛选培养基：在100ug/ml〜1000ug/ml范围内按0ug/ml、 100ug/ml、200ug/ml、300ug/ml、400ug/ml， 500ug/ml、600ug/ml、700ug/ml、800ug/ml， 900ug/ml、 1000ug/ml 浓度用无抗无血清培养基稀释 G418 制成筛选培养基心得：由于特 性明确的细胞系G418的最佳用量还是比较稳定的，所以有时候不需要在这么大范围内进行 筛选比如说你要转染NIH3T3细胞，现在我告诉你我测试过NIH3T3细胞对G418的敏感 性，我用的筛选浓度是200 ug/ml。

这时你就可以做150ug/ml、200ug/ml、300ug/ml三个 浓度进行筛选 3. 培养待转染（而不是转染后）的细胞筛选的目的是杀灭未转染的细 胞） 4. 取对数生长期的细胞（一般在铺满培养器皿底部的 70%~80%时），用新鲜无抗无血 清的培养基制成1X104个/ml的细胞悬液5.向96孔培养板中加细胞悬液，每孔100 微升（使每孔细胞数在1X103个），然后向每孔加新鲜无抗无血清的培养基适量，培养箱 中静置培养这样做是为了保证在固定细胞密度下确定最佳G418药物筛选浓度汇合 度：实际上就是指细胞占培养表面的比例，如果细胞铺满了整个容器，我们就认为它们100% 汇合，也就是汇合度 100%汇合度对 G418 筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜 超过 50% ！ 6. 培养 6 小时左右开始加药加筛选培养基筛选: 吸除培养孔中培养基， PBS 洗涤一次，每孔中加入不同浓 度的筛选培养基适量 7. 换液： 每日检查细胞活力，根 据细胞活力和培养基的颜色，每三天（ 即每隔两天）更换筛选培养基一次 如细胞生长过快， 可以缩短换液时间（每隔一天）有死细胞勤换液，可以减少对存活细胞的影响。

8. 确定 最佳筛选浓度：在正常的实验操作规程时 ，一种细胞最优筛选浓度的确立时间随细胞的生 长率和一般生存时间而定，在筛选10〜14天内能够杀死所有细胞的最小G418浓度即为最 佳筛选浓度 在第一轮就筛选出最佳 G418 浓度的可能性不大，最有可能的是出现这种情 况：用某一浓度 G418 的量在筛选 14 天后还不能杀死细胞，而用下一个梯度的 G418 的量 在10天前就看不到活细胞了假如是400ug/ml不能杀死细胞，而800ug/ml在第5天就把 所有细胞都杀死了，则可以再用500ug/ml、600ug/ml、700ug/ml进一步筛选，以确定最佳 筛选浓度二） 转染细胞 1. 第一天：在 60mm 培养皿内种植细胞，细胞密度为能使第二天细胞融合 能达到70%-80%的密度，C02孵箱 过夜培养2.第二天：准备3ml无抗生素无血清培养 基，加入Polybrene，终浓度为8 u g/ml将已经制备的病毒颗粒0.5 ml加至上述培养基， 轻吹混匀去除60mm培养皿内的旧的培养基，加入含病毒培养基Polybrene能够增加病 毒感染的效率，然而，有时候Polybrene对细胞有毒性。

这时，可以用Protamine Sulfate代 替Polybrene） 3.转染后培养24小时或者更长，到细胞增长接近70%汇合时按1： 4密度 传代，继续培养，待细胞密度增至50%〜70%汇合时开始筛选三）筛选细胞1.加G418：去掉培养液，PBS洗一次，加入按最佳筛选浓度配制好的G418 筛选培养基（无抗无血清） （ 实 际应用时可以比最佳筛选浓度高一级别） 2. 换液：根据 培养基的颜色和细胞生长情况，每3~5天更换一次筛选培养基当有大量细胞死亡时，可以 把G418浓度减半维持筛选筛选10〜14天后，可见有抗性的克隆出现，停药用完全培养 基培养 3. 待其逐渐增大后，挑出单克隆：制备细胞悬液，细胞计数，用培养基稀释细 胞到1个/10ul在96孔板中加入培养基150ul/孔，再加入细胞悬液10ul/孔待其逐渐增 大后转入到48孔中增殖4.单克隆鉴定：细胞大量扩增后，提取总RNA,做RT-PCR检测 目的基因是否存在典型!占甦［I胞T扳空度垢弄板人J二长:面駅（cm3）人约细胞融瞬基吝恕＞l）组纫音养JEU Cqj 60mm)286. 6■< 1D:5-6州丄詩饭〔甲35mm'：9.51-21/?，主衣酿qj 2匕Em ml41. 3 a 1OEil. “固孑"訝训8mm；□. 50. 6 ：< 10E0. 25-0. 5。