螺旋藻多糖对免疫低下小鼠淋巴细胞增殖及促进IFN-γ的诱生作用.doc

1螺旋藻多糖对免疫低下小鼠淋巴细胞增殖及促进IFN-γ 的诱生作用【摘要】 　　目的观察螺旋藻多糖对环磷酰胺所致的免疫低下小鼠淋巴细胞增殖作用和细胞因子 IFN-γ 的影响，探讨其对机体的免疫调节作用 方法选择健康的雄性昆明种小鼠腹腔注射环磷酰胺制备免疫低下小鼠模型采用 MTT 法检测细胞增殖；酶联免疫法测定脾细胞培养上清 IFN-γ 的浓度 结果用药组小鼠脾细胞、胸腺细胞增殖 OD 值及小鼠脾细胞培养上清 IFN-γ 值与模型对照组相比均有显著性差异（P<0.05 或 P<0.01） 结论螺旋藻多糖能够促进小鼠淋巴细胞增殖，并通过诱生 IFN-γ 而发挥免疫调节作用 【关键词】 螺旋藻多糖 免疫低下 淋巴细胞增殖 γ-干扰素Abstract:ObjectiveTo observe the effect of Spirulina platensis polysaccharide on lymphocyte proliferation and IFN-γ induction in immunosuppressive model mice caused by cyclophosphamide. MethodsHealthy male Kunming mice were induced to establish immunosuppressive model by the peritoneal injection of Cyclophosphamide. MTT colorimetry was used to examine the cell proliferation of spleen cell and thymus cell. IFN-γ concentration of cultural supernatant from 2spleen cell was determined by enzyme linked immunosorbent assay.ResultsCompared with the model group, the lymphocyte proliferation and IFN-γ production were increased significantly in PSP groups (P<0.05,0.01).ConclusionPolysaccharide from Spirulina platensis has immune regulative effect by promoting the cell proliferation and IFN-γ induction.Key words:Polysaccharide from Spirulina platensis; immunosuppression; Lymphocyte proliferation; IFN-γ螺旋藻多糖(polysaccharide from Spirulina platensis, PSP)是从螺旋藻中提取的一种酸性、水溶性的杂多糖，除了具有丰富的营养价值外，还具有多种生物活性和免疫调节功能，如：抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、抗辐射等作用，已成为国内外药物研究开发的热点之一。

本实验观察了 PSP 对免疫低下小鼠淋巴细胞的增殖情况及其对 IFN-γ 的诱生作用，为阐明 PSP 的免疫调节作用机制提供实验依据1 器材与方法1.1 材料31.1.1 螺旋藻多糖的提取采用改良的三氯乙酸去蛋白法从螺旋藻中提取出的粗多糖，硫酸蒽酮法测定糖含量为 90%以上1.1.2 动物昆明种小鼠（KM 小鼠） ，雄性，6 ～8 周龄，体重 18～22 g，由广东医学院实验动物中心提供1.2 试剂与仪器RPMI-1640 培养基（美国 GIBCO 产品） ；新生牛血清（杭州四季青生物工程研究所） ；ConA（Sigma 公司） ；四甲基偶氮唑盐（MTT, Sigma 公司） ；ELISA 试剂盒（武汉博士德生物公司） ，其余试剂为国产分析纯酶标仪：ELx8009 （BIO-TEK 公司） 1.3 动物模型分组、制备及给药方法取健康昆明小鼠 50 只，随机分为 5 组：正常对照组 (A 组) 、模型对照组(B 组)和 3 组不同浓度螺旋藻多糖模型组(C，D，E 组) ，每组 10 只A 组每只小鼠腹腔注射生理盐水 1 ml/d，连续 10 d；B，C，D 和 E 组每只小鼠先腹4腔注射环磷酰胺 2 mg/d，连续 3 d，第 4 天开始分别注射生理盐水和不同浓度的螺旋藻多糖，连续 7 d；观察免疫低下模型组小鼠与正常对照组小鼠比较，活动度降低、毛皮颜色较暗、无光泽等，表明造模成功。

1.4 检测指标1.4.1 小鼠脾细胞和胸腺细胞悬液的制备无菌条件下拉颈处死小鼠，取出脾脏和胸腺，去脂肪和结缔组织，分别放入盛有适量RPMI-1640 培养液的培养皿内，剪碎置于培养皿中，用毛玻璃轻轻研磨，使细胞悬于 RPMI-1640 培养液中，然后用 8 层无菌纱布滤出单细胞悬液，然后用 RPMI-1640 培养液洗两次，将洗过的细胞悬液悬浮于含 10%新生小牛血清的 RPMI-1640 完全培养液中，用0.4%台盼蓝染料计数细胞的活细胞率为 95%以上1.4.2 小鼠脾细胞和胸腺细胞增殖实验将细胞悬液接种于 96孔培养板，脾细胞 2×105/孔、胸腺细胞 4×106/孔，然后每孔加入5 μg/ml ConA 50 μl，六复孔培养，于 37℃ ，5%CO2 培养箱中培养 68 h 后，加入 5 μg/ml MTT10 μl/孔，继续培养 4 h，再加入三联液 100 μl/孔，混匀，放置过夜，次日用酶标仪检测各孔的吸光度OD570nm 值51.4.3 对脾细胞产生 IFN-γ 的影响将脾细胞悬液接种于 24 孔培养板，5×105/孔，在 37℃，5%CO2 培养箱中培养 48 h，收集上清，冻存于-20℃ 。

根据 ELISA 试剂盒方法说明操作，测定 IFN-γ的含量1.5 统计学处理用±s 表示，应用 SAS8.1 统计软件进行单因素方差分析2 结果2.1 螺旋藻多糖对环磷酰胺所致免疫低下小鼠脾细胞/胸腺细胞增殖反应的影响结果见表 1表 1 螺旋藻多糖对环磷酰胺所致免疫低下小鼠脾细胞/胸腺细胞增殖反应的影响(略)表 1 结果表明，与正常对照组相比，模型组小鼠的脾细胞增殖 OD 值显著降低（P<0.01 ） ，胸腺细胞增殖 OD 值显著降低（P<0.01） ，说明制备免疫低下模型成功高、中、低剂量螺旋藻多糖可显著促进免疫低下小鼠脾细胞和胸腺细胞增殖（P<0.05或 0.01） 62.2 螺旋藻多糖对环磷酰胺所致免疫低下小鼠脾细胞产生细胞因子 IFN-γ 的影响 结果见表 2表 2 螺旋藻多糖对环磷酰胺所致免疫低下小鼠脾细胞产生 IFN-γ 的影响(略)表 2 结果表明，与模型组相比，高、中、低剂量螺旋藻多糖组均可促进免疫低下小鼠分泌 IFN-γ（P<0.05 或 P<0.01）3 讨论普遍认为多糖是一种免疫调节剂，具有无细胞毒性的特点，来源不同的多糖对机体的免疫功能具有不同程度的免疫调节作用，能够分别或同时激活 T 细胞、B 细胞、NK 细胞和巨噬细胞等免疫细胞，促进免疫细胞分泌细胞因子，增强机体的非特异性免疫、体液免疫和细胞免疫，被认为是一种重要的生物效应调节剂。

螺旋藻多糖是一种无毒性的水溶性酸性多糖，其分子量约为 12 000～16 000，是由多种单糖组成的杂多糖小鼠腹腔注射螺旋藻多糖能明显增加脾重，显著促进小鼠血清溶血素的形成和提高小鼠巨噬细胞的吞噬率和吞噬指数［1］ ；螺旋藻由于其高浓度的营养成分使其具有多种生物活性和营养作用，具有生物调节和免疫调节的功能不同的螺旋藻制剂能够影响免疫系统，如增加巨噬细胞的吞噬活性、7刺激抗体和细胞因子的产生、提高组织中 NK 细胞的积聚、提高 NK细胞的杀伤能力以及激活、活化 T、B 淋巴细胞［ 2,3］ Al-Batshan HA 等［4 ］研究发现螺旋藻能够增强鸡的单核巨噬细胞功能，从而增强鸡的抗病能力Hirahashi 等［ 5］采用热水抽取法提取螺旋藻多糖，并研究发现其能增强 NK 细胞的杀伤能力胸腺和脾脏是机体的重要免疫器官一些免疫增强剂可以使胸腺和脾脏增重，而免疫抑制剂则可使其萎缩免疫器官细胞增殖分化受到抑制，就会使机体淋巴细胞总数降低，从而使机体免疫功能下降环磷酰胺是较强的烷化剂，可杀伤各种免疫细胞，抑制各种动物的体液与细胞免疫应答［6］ ，使 CD4+T 细胞明显抑制，导致免疫抑制小鼠 IFN-γ 分泌降低。

本实验结果表明，环磷酰胺能够明显抑制小鼠脾细胞和胸腺细胞的增殖和脾细胞分泌细胞因子 IFN-γ，说明制备免疫低下模型成功运用 MTT 法检测了正常对照组、模型组及螺旋藻多糖治疗各剂量组小鼠脾细胞和胸腺细胞的增殖情况，发现用螺旋藻多糖治疗各剂量组均能逆转由环磷酰胺引起的脾细胞和胸腺细胞增殖抑制，显著促进脾细胞和胸腺细胞增殖，说明 PSP 能明显增强环磷酰胺处理的小鼠淋巴细胞对 ConA 诱导的转化能力，从而提高了免疫细胞的免疫活性IFN-γ 是一种主要由 Th1 细胞分泌或旁分泌的细胞因子，可通过活化 NK 细胞和细胞毒性 T 细胞，发挥抗病毒、抗肿瘤和免疫8调节等生物活性PSP 能够促进环磷酰胺处理的小鼠脾淋巴细胞IFN-γ 的分泌，说明 PSP 可以通过调节细胞因子的分泌而影响机体的免疫功能本实验研究结果表明螺旋藻多糖通过增强机体淋巴细胞增殖功能和影响细胞因子的分泌来调节机体免疫系统，有助于进一步说明 PSP 的免疫调节作用机制，对 PSP 进一步的开发利用提供了实验依据参考文献】［1］左绍远,朱正宇, 马涧泉.螺旋藻多糖 ( PSP) 对免疫功能的影响［J］.药物生物技术,1996 ,3 (3) ：158.［2］Khan Z, Bhadouria P, Bisen PS. Nutritional and therapeutic potential of Spirulina［J ］. Curr Pharm Biotechnol , 2005 ,6(5):373.［3］涂芳, 杨 芳,郑文杰,等. 螺旋藻多糖的研究进展［J ］. 天然产物研究与开发, 2005,17(1):115.［4］Al-Batshan HA, Al-Mufarrej SI, Al-Homaidan AA, Qureshi MA. Enhancement of chicken macrophage 9phagocytic function and nitrite production by dietary Spirulina platensis. Immunopharmacol Immunotoxicol, 2001 ,23(2):281.［5］Hirahashi T, Matsumoto M, Hazeki K, et al. Activation of the human innate immune system by Spirulina: augmentation of interferon production and NK cytotoxicity by oral administration of hot water extract of Spirulina platensis, 2002, 2(4):423.［6］江明性. 药理学［M］. 北京：人民卫生出版社,1996：343.。