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基因工程药物的生产原理及其应用摘要：近年来，基因工程药物在目的基因制备、载体的构建、基因转移技术、宿主表达系统和生物反应发 生器等方面取得了令人瞩目的成就本文简单介绍基因工程药物的生产原理及其重要应用 关键词：基因工程药物 生产原理 应用随着基因研究的深入，人类已经可以生产出许多基因工程产品基因工程药物引入医 药产业,由此引起了医药工业的重大变革,使得医药产业成为最活跃、发展最快的产业之一， 同时大大提高了21世纪人类的整体健康状况基因工程药物又称生物技术药物是指利用基因工程技术研制和生产的药物，是根据人 们的愿望设计的基因，在体外剪切组合，并和载体DNA连接，然后将载体导入靶细胞（微生物、 哺乳动物细胞或人体组织靶细胞） ,使目的基因在靶细胞中得到表达,最后将表达的目的蛋白 质纯化及做成制剂,从而成为蛋白类药或疫苗主要种类有：胰岛素、单克隆抗体、荷尔蒙 干扰素、白细胞介素、组织型纤溶酶原激活因子、红细胞生成素、集落刺激因子1 生产原理 基因工程制药技术分获取目标基因的上游技术和大量培养上游技术阶段上游技术实 质就是基因工程技术下游技术则包括菌体培养，细胞破碎，大量培养以及分离纯化几个 步骤。

1.1 基因工程制药的上游技术 基因工程是生物工程的一个重要分支，它和细胞工程、酶工程、蛋白质工程和微生物 工程共同组成了生物工程 所谓基因工程是在分子水平上对基因进行操作的复杂技术，是 将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻 译表达的操作它是用人为的方法将所需要的某一供体生物的遗传物质——DNA大分子提取 出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来， 然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中，以让外源物质在其中“安家落 户”，进行正常的复制和表达基因工程研究采用的技术方法很多，以下介绍常见基本两种：聚合酶链反应技和Sanger 双脱氢链终止法1.1.1 聚合酶链式反应聚合酶链式反应，其英文Polymease Chain Reaction（PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引 物PCR由变性一退火一延伸三个基本 反应步骤构成：① 模板DNA的变性：模板DNA经加热至93°C左右一定时间后，使模板DNA双链 或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与 引物结合，为下轮反应 作准备；② 模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55 C 左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③ 引物的延伸：DNA模板一引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为 反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保 留复制原理，合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性一退火一延伸三过程，就可获得更多的“半保留 复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。

每完成一个循环需2〜4分钟，2〜 3小时就能将待扩目的基因扩增放大几 百万倍现在有些PCR因为扩增区很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复 制完成，因此可以改为两步法，即退火和延伸 同时在60°C-65°C间进行，以减少一次 升降温过程，提高了反应速度1.1.2双脱氢链终止法 核酸模板在核酸聚合酶、引物、四种单脱氧碱基存在条件下复制或转录时，如果在四管反 应系统中分别按比例引入四种双脱氧碱基，只要双脱氧碱基掺入链端，该链就停止延长， 链端掺入单脱氧碱基的片段可继续延长如此每管反应体系中便合成以共同引物为 5'端， 以双脱氧碱基为 3'端的一系列长度不等的核酸片段反应终止后，分四个泳道进行电泳 以分离长短不一的核酸片段（长度相邻者仅差一个碱基），根据片段 3'端的双脱氧碱基，便 可依次阅读合成片段的碱基排列顺序主要步骤如下：Sanger双脱氧链终止法（酶法）测序程序 操作程序是按DNA复制和RNA反转录的原理设计 的1•分离待测核酸模板，模板可以是DNA，也可以是RNA，可以是双链，也可以是单链2.在 4只试管中加入适当的引物、模板、4种dNTP （包括放射性标记dATP，例如?32 PdATP 和DNA聚合酶（如以RNA为模板，则用反转录酶），再在上述4只管中分别加入一种一定 浓度的ddNTP（双脱氧核苷酸）。

3•与单链模板（如以双链作模板，要作变性处理）结合的引物，在DNA聚合酶作用下从 5'端向3'端进行延伸反应，32P随着引物延长掺入到新合成链中当ddNTP掺入时，由 于它在3'位置没有羟基，故不与下一个dNTP结合，从而使链延伸终止o ddNTP在不同位 置掺入，因而产生一系列不同长度的新的DNA链4.用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳同时分离4只反应管中的反应产物，由于每一反应管中只 加一种ddNTP（如ddATP），则该管中各种长度的DNA都终止于该种碱基（如A）处所以凝 胶电泳中该泳道不同带的 DNA3' 末端都为同一种双脱氧碱基5•放射自显影根据四泳道的编号和每个泳道中DNA带的位置直接从自显影图谱上读 出与模板链互补的新链序列1. 2 基因工程制药下游技术1.2.1 基因工程菌的培养 基因工程菌的培养过程主要包括：① 通过摇瓶操作了解工程菌生长的基础条件；② 通过培养罐操作确定培养参数和控制的方案以及顺序 由于细胞生长和异源基因表达之间有着较大的差异，各培养参数在全过程中必须分段控制培养方式主要有：一、 补料分批培养 补料分批培养是将种子接入发酵反应器中进行培养，经过一段时间后，间歇或连续地补加新鲜培养基，使菌体进一步生长的培养方法。

二、 连续培养 连续培养是将种子接入发酵反应器中，搅拌培养至一定菌体浓度后，开动进料和出料的蠕动泵，以控制一定稀释率进行不间断的培养连续培养可为微生物提供恒定的生活环 境，控制其比生长速率三、 透析培养 透析培养是利用膜的半透性原理使代谢产物和培养基分离，通过去除培养液中的代谢产物来解除其对生产菌的不利影响采用膜透析装置是在发酵过程中用蠕动泵将发酵液打 入罐外的膜透析器的一侧循环，其另一侧通入透析液循环四、固定化培养 基因工程菌经固定化培养后，解决了质粒的稳定性问题，该培养方式对分泌型菌更为 有利1.2.2 基因工程菌细胞的破碎 现今，在基因工程菌的研究中，主要涉及有细菌，酵母和藻类微生物的细胞壁比较 坚韧目前已发展了多种细胞破碎方法，以便适应不同用途和不同类型的细胞壁破碎 破碎 方法可规纳为机械法和非机械法两大类机械法有很多类型，常见的有：高压匀浆破碎法( homogenization )，振汤珠击破碎法 (Skaking Bead),高速搅拌珠研磨破碎法(fine grinding), 超声波破碎法(ultrasonication)非机械法有如下类型：渗透压冲击破碎法(osmotic shock ),冻融破碎法(freezing and thawing)，酶溶破碎法(enzyme lysis)，化学破碎法(chemical treatment)，去垢剂破碎 ( detergents ) 。

1.2.3 基因工程蛋白的分离和纯化基因重 组产物均在其宿主细胞 内克隆表达，且大多为胞 内物质基因重组蛋 白的分离和纯 化，由于目标产物的 性质和对产品纯化要求不同 ，其分离和纯化的方法 和选择的纯化 路径也不同，但主要分 为两个方面： 1.目标产物 的粗级分离，主要是在 细胞培养后， 将细胞从培养液中分离出来，然 后再破碎细胞释放产物，溶解 包含体， 复原蛋白质以 除去大部分杂质； 2.目 标产物的纯化，这是在分 离的基础上，用各种具 体高选择性的 精密仪器，使产物的纯度和回收 率主要分离技 术:1．离心及沉淀 离心分离的原理是 在转子高速转动所产生的离心力 的驱动下，利用固体及液 体间的密度差来进行悬浮液 ，乳浊液的分离 沉淀原理是利用油和杂质 的不同密度， 借助策略的作用，达到自然分离 才者的一种方法2. 膜分离 膜分离是在20世纪初出现，20世纪60年代后迅速崛起的一门分离 新技术膜分离技术由于兼有分离、浓缩、纯化和精制的功能，又有高效、节能、环保、 分子级过滤及过滤过程简单、易于控制等特征，因此，目前已广泛应用于食品、医药、生 物、环保、化工、冶金、能源、石油、水处理、电子、仿生等领域，产生了巨大的经济效 益和社会效益，已成为当今分离科学中最重要的手段之一。

3. 双水相 萃取 某些亲水性高分子聚 合物的水溶液超过一定浓度后 可以形成 两相，并且在两相中水分均占很大比 例，即形成双水相系统 利用亲水性高分子聚合 物的水溶液可 形成双水相的性质， Albertsson 于 20 世纪 50 年代后期开发了双水相 萃取法，又称 双水相分配法 20 世纪 70 年代,科学家又发展了双水相萃取在生物分 离过程中的应 用，为蛋白质特别是胞内蛋白质 的分离和纯化开辟了新的途径 4. 反胶团萃取 蛋白质溶解于小水池中(正萃，或称萃取)，其周围有一层水膜及 表面活性剂极性头的保护，使其避免与有机溶剂接触而失活改变pH、盐浓度等条件蛋白 质又可回到水相(反萃)，实现了蛋白质的萃取分离、纯化目的反胶团萃取蛋白质的机理 目前尚不十分清楚一般认为，萃取过程是静电力、疏水力、空间力、亲和力或几种力协 同作用的结果，其中蛋白质与表面活性剂极性头间的静电相互作用是主要推动力根据所 用表面活性剂类型，通过控制水相pH高于或低于蛋白质的等电点(pl)，达到正萃反萃的目 的2 基因工程药物应用事例2.1 胰岛素 胰岛素是基因工程药物最重要的代表胰岛素是由胰产生的一种蛋白它在人体新陈 代谢中起着重要作用，如果体内不足就会引发糖尿病，因此胰岛素是治疗糖尿病的特效药。

这种病发病率很高，困扰着上千万人过去从猪、牛胰中提取胰岛素，产量低，满足不了 患者的需求现在利用基因工程技术，有两种方法可以让微生物发酵产生胰岛素一种是 先在大肠杆菌中分别合成胰岛素 A 链和 B 链，然后再在体外用化学方法将两条链连接成胰 岛素美国 Eli lilly 公司采用这种方法生产胰岛素另一种是采用分泌型载体表达胰岛 素原，然后再将其转化为胰岛素丹麦NovNordisk公司就是采用重组酵母分泌产生胰岛 素原，再用酶法转化为人胰岛素2.2 干扰素 干扰素是病毒入侵人体或其他动物后，机体产生的可以对多种病毒具有抵抗能力，抑制它们复制、增殖的一种蛋白质它是一类在同种细胞上具有广谱抗病毒活性的蛋白质， 其活性受细胞基因组的调控在一般生理状态下，细胞的干扰素基因呈静止状态，只有在 干扰素诱导剂作用下，干扰素基因才进行转录并翻译出具有种属特异性的干扰素干扰素 本身不能直接杀灭活病毒，但是它能使细胞产生许多抗病毒蛋白质，使病毒的 mRNA 不能和 核酸体结合，因而无法合成病毒蛋白质，从而减少了新病毒粒子的合成，阻断了病毒的增 殖它在临床上主要用于恶性肿瘤和病毒性疾病的治疗过去，干扰素一般只能从感染病毒的人血液中的白细胞或纤维中提取，量少价昂，难以 应用于临床。

1980 年美国基因技术公司把人体血细胞干扰素基因转移到大肠杆菌或酵母菌 中，成功表达其中a、0、r种干扰素已工业化生产，产品已投放市场我国也已生产出 a 型和 r 型干扰素2.3 重组疫苗所谓重组疫苗就是利用重组 DNA 技术，克隆并表达抗原基因的编码序列，并将表达产 物用作疫苗重组疫苗的重要性在于它可以替代灭活或无感染力的病原微生物来进行免疫 第一个应用于人体的重组疫苗是用酵母菌生产的乙肝疫苗它是将乙肝表面蛋白抗原基因 在酵母菌 中克隆和表达，生产出来的蛋白及其聚合物与在感染体内发。